大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）的改造——EcoliBL21（DE3）lpxM突变菌株的构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌的构建.pdfVIP

捅 斐 本研究利用Red同源重组技术从分子水平对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21 (DE3)进行了改良——①使叵coliBL21(DE3)的Jpx出I基因发生插入失活， 构建了Jpxlijt突变菌株；②在lpxg位点敲入带有OmpA信号肽的金黄色葡萄球菌 核酸酶基因，构建了破菌时可自动降解宿主核酸的菌株。以期方便、有效地降低 所表达重组蛋白的内毒素污染、核酸污染，以及降低因宿主菌染色体核酸释放导 致的破菌液的黏度，为产品纯化和质量提高打下基础。 1、助砌基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建同源臂500bp左右的打 靶载体，借助Red同源重组系统，使E 失活，再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒peP20去除抗性基因。通过PCR 鉴定发生插入突变的菌株，应用SDS—PAGE分析突变前后的脂多糖以及考查对 重组蛋白表达的影响。PCR鉴定结果说明lpxkl基因发生了插入突变。与出发 株比较，突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化，但其生长状态与表达重 组蛋白的能力与出发株基本一致。为后续敲入外源功能基因，改造E．eoliBL2l (DE3)提供一个可行、方便的靶位点，同时该突变株生产的药用重组蛋白， 引发内毒素反应的可能性大大降低。 2、构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌，高效、廉价地解决 因宿主菌染色体核酸释放导致裂解液高粘度给后续纯化重组蛋白工作带来的 困难，并减轻重组蛋白终产品中的核酸污染。在已证实lpxM笨因失活对最coll BL21(DE3)生长状态与表达重组蛋白的能力没有影响的基础上，将N端连有 ompA的信号肽的只a“re“s 达产物可转运至周质空间。改造后菌株一--BLN经诱导能表达nucB、并存于周 质空间，菌体裂解后能自动降解宿主核酸，降低裂解液黏度。与出发菌比较， 其菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力不受影响。 周质空间 Abstract This usedRedrecombinationto Escherichiacoli study systemmodify strain．AmutantE．coli BL21(DE3)，apopularproteinproduction BL2I(DE3)with inactivated strain of andamodifiedE．coli with lpxM proteinproduction capable acidwere in toreduceLPS hostnucleic constructedorder autohudrolysing contaminationand inthe anddecrease nucleicacidcontamination expressedprotein the ofcell iscaused molecularchromosomal viscosity which high weight lysates by DNAofthehostcell． in 1、Mutationsthe alow lpxMgeneproduceendotoxicitylipopolysaccharide． constructeda vectorwithab