大肠杆菌及金黄色葡萄球菌AI2群体感应系统的调控研究.pdfVIP

摘要 摘要 大多数情况下，环境中的细菌都不是以单个、液体浮游的形式存在，而是生长 在一个复杂的群体中，这个群体往往包含一种或多种细菌。同时由于环境的变化 差异较大，细菌必须具备通过感知外界环境变化调节相应基因的表达从而更加适 应所处的环境的能力。尤其是对于致病菌而言，这一能力更加至关重要。因此， sensing)。群体 成细胞与细胞问交流的重要机制，通常被称为群体感应(quorum 感应过程中，细菌合成并向胞外分泌信号分子。胞外聚集的信号小分子的浓度和 细胞的数量成正相关，当信号分子的浓度达到一定阈值时，它们可以通过进入胞 内或者与膜上的受体蛋白结合，产生一系列的调控作用，进而使整个菌群产生协 调一致的基因表达变化，并采取一些对整个菌群有利的行为方式，从而使细菌完 成群体感应的基冈调控行为。 在茸前己发现的细菌信号感应系统中，以酰基高丝氨酸内酯AHL 菌，特别是变形杆菌类都以AHL作为种内群体感应的信号分子；革?皇氏阳性细菌 通常利用寡肽(oligopeptide)作为种内群体感应的信号分了；同时还有一种特 殊的信号感应系统，既存在于革兰氏阴性菌，同时也存存丁．革兰氏阳性菌中，其 菌的AHL与革兰氏阳性菌的寡肽特异性较高，主要负责种内细菌之间的通讯，而 AI一2及其合成酶LuxS保守且广泛存在于细菌中，人们推测AI一2可能在细菌种间的 通讯中起重要作用。此外，LuxS被证明在细菌中具备舣重功能(代谓}与信号)， 它既是甲基循环巾一个重要的代谢酶，同时又往这一代谢过程·}·合成了副产物 AI一2作为信号分子。目前的研究已经发现LuxS／AI一2系统日J．以调节哈氏9双菌 形成、霍乱弧菌(玎圳D幽DJ嗍)的毒性以及绿脓杆菌(咫8“棚as a删门D船)的致病性等等。然而，在革兰氏阳性菌中，尽管时有少量的表型层 面的研究证据被报道，LuxS／AI一2系统是否具备信号调控的功能口前仍颇具争议， 尤其在可以广泛引起人类疾病的重要致病菌如金黄色葡萄球菌中，这方面的研究 工作还很不够。 据目前所知，AI一2的合成通路非常保守，但AI一2的信号感应与传递机制在 不同细菌种间是有差异的。目前，仅在少数几种细菌中，有关于AI一2的信号感应、 传递及调控机制的研究报道，即哈氏弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌(船J用∞PJ儿 摘要 Typhimurium)和大肠杆菌。在沙门氏菌和大肠杆菌中，早期被排m胞外的AI一2 需耍在对数后期被运回胞内来行使调控功能。存细胞生长的前期，A工一2不断在胞 外聚集，而一旦细胞生长进入了稳定期，胞外AI一2的量则急剧下降。究其原因， AI一2是被Lsr转运体(Lsrtransporter)运入了胞内。基因组上，』甜操纵子上 游有一个反向转录的基因-甜兄编码蛋白LsrR。早期的研究证明，LsrR可以抑制 i)((HTH) -s撩纵子和它自身的转录。三级结构预测LsrR含有一个Helix—turn—hel 的DNA结合结构域，故推断它是通过直接与-甜和它自身基冈的肩动子区域结合产 生抑制作用，不过之前还没有确切的证据。此外，据Xavier等人报道，LsrR还具 有一个配体结合结构域，该结构域可与AI—Z结合，即LsrR是群体感应信号分子 AI一2在胞内的受体，故而推测其可作为AI一2在胞内的效应单元产生对下游靶基因 的调控行为，转录组学的实验证据也证明LsrR缺陷的菌株中有近百个基因水平有 明显变化，提示LsrR存细菌中可能做为一个重要的宏观转录因子(910bal regulator)在群体感应行为中发挥主要作用。 本课题通过DNA凝胶阻滞实验，首次证明LsrR抑制基因表达足通过直接结合于 他们的启动子区域的方式，给出了LsrR可以作为转录因子行使功能的直接体外证 据；通过DNA足迹法(DNA 合序列，为将来LsrR蛋白新的下游调摔靶点的寻找提供了最胄：接的实验依据：通 过生物信息学比对以及B一半乳糖苷酶活性实验，进‘步对LsrR蛋白的特异性结 合序列深入研究，发现在lsrR和1srA的启动子的结合序列内，各有两个富含AT 的医域对LsrR的结合至关重要。最后，我们通过体外磷酸化实验与凝胶阻