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大肠杆菌条件性基因表达调控系统的构建与应用 摘要 随着许多生物基因组测序的完成，功能基因组学逐渐成为人们研究 的重点。其中，必需基因由于其序列的保守性，对细胞功能的核心作 用及其作为药物作用靶点的潜能而吸引了研究者更多的注意。由于传 统的基因敲除方法对必需基因的操作会引发细胞致死效应，难于直接 对其分析，亟需开发新的基因功能研究系统。据此，我们构建了两套 大肠杆菌(Escherichiacoli)条件性基因表达调控系统，本文主要介绍 了这两套系统各自的原理及其应用。 常用系统；与其他系统相比，TS突变体具有反应速度快、应用范围广 intein) 和可逆性高等优势。在此，我们将温度敏感的蛋白质内含肽(TS 与大肠杆菌T7蛋白表达系统相结合，构建了一套温度敏感的T7表达 系统，从而制造目的基因温敏表型的大肠杆菌。将一个温度敏感的酿 cerevisiaevacuolar ATPase)的蛋白内含 酒酵母VMA(Saccharomyces 肽基因插入T7RNA聚合酶编码基因的A1a 492处。改造后 491和Cys 的T7RNA聚合酶仅在允许温度(18℃)才具有活性，才能起始T7 启动子下游基因的转录，产生目的蛋白；而在非允许温度(37℃)， 由于胞内不存在目的蛋白，细胞表现为基因敲除表型。我们利用13．半 先，我们构建了温度敏感的T7RNA聚合酶并验证了其温度敏感性。 体外T7RNA聚合酶活性实验表明含野生型内含肽的T7RNA聚合酶 在任何温度下都具有活性，而不能剪切的内含肽的插入则可以完全抑 制T7RNA聚合酶的活性。这说明A1a 492处内含肽的插入 491和Cys 是有效的，内含肽的剪切与否直接调控T7RNA聚合酶的活性。外源 蛋白表达效率实验表明含温敏内含肽的T7RNA聚合酶的活性直接受 温度的控制；允许温度下，含温敏T7RNA聚合酶的菌株可高效表达 外源蛋白，其水平与带有野生型T7RNA聚合酶(不含内含肽)的菌 株中该蛋白的表达水平基本一致。为了研究温敏的T7RNA聚合酶对 目的基因表达的调控是否可使细胞呈现该基因的温敏表型，我们又进 行了细胞表型实验。结果表明，含温敏T7RNA聚合酶的菌株在允许 温度下呈现野生菌株表型，而在胁迫温度下则呈现基因敲除表型。这 说明把目的基因插入T7启动子下游，温敏，r7表达系统会使细胞呈现 温敏突变体表型。进一步我们分析了温敏T7表达系统的调控机制。定 量PCR结果表明，有活性T7RNA聚合酶存在(18℃)时目的基因的 转录量是无T7RNA聚合酶存在(37℃)时的85．90倍左右。同时， 单个菌细胞的目的转录子个数检测结果表明无T7RNA聚合酶时(37 RNA聚合酶 ℃)，胞内几乎不能检测到转录子的存在。这说明温敏T7 在允许温度下可以高效启动T7启动子下游基因的转录，在胁迫温度下 则不能；而大肠杆菌RNA聚合酶在任何温度下都不能启动T7启动子 II 下游基因的转录。也就是说，在此温敏T7表达系统中，因大肠杆菌 RNA聚合酶识别启动子而产生的背景极低。WesternBlot和酶活性实验 则表明，当没有T7RNA聚合酶存在时(37℃)，温敏T7表达系统中 几乎不能检测到目的蛋白；而18℃时，因有活性T7RNA聚合酶的存 在，可检测到大量有活性的目的蛋白。这说明，目的蛋白的表达直接 与T7RNA聚合酶的活性相关，即含温敏T7表达系统的菌株在允许温 度下可以正常地表达目的蛋白，而胁迫温度下则不能。同时，胁迫温 度下目的基因的表达终止实验表明含温敏T7表达系统的菌株在从允 许温度转入胁迫温度约1小时后，胞内已几乎不能检测到目的蛋白的 存在。这说明温敏T7表达系统对温度十分敏感；转入胁迫温度后，含 温敏T7表达系统的菌细胞中目的基因的表达可以被迅速而有效地终 止。总之，上述所有结果充分证实该温敏T7表