巴西固氮螺菌Sp7中与NifA相互作用的阳性因子的基因克隆和功能分析.pdfVIP

摘要 brasilense)Sp7是一种联台l嘲氯菌，与其他矧氮细菌一一样，在 巴鹳园氮螺蕾叫zospwillum 该赭中NifA蛋白∞口A基冈的产物)廷蚓氮基因∞矿基冈)的转录激活接岛。环境闲f氧和铵对 蜘氮作j；}；}的影响是通过调控神名基因的表达和NifA蛋向的活性来实现的。目前，在该菌中既没 有发现类似FixL／J双组分调节系统，也没有发现NitL蛋白。因此，氧和铵对NifA蛋冉活性的调 节机制有待进一步研究。 brasilense 本研究室利用酵母双杂交系统，以NifA蛋白为诱饵，从A Sp7染色体DNA文库 中筛选到四个和NifA蛋白有直接相互作用的蛋白的编码基因。DNA序列分析表明，这四个刚性 r3 克隆包含了1～l kb不等的不完整的基因片段，与pGAD-C(X)载体构成融合质粒，依赖手载体 起贻翻译和终止。为了研究其功能，在本研究中．对这四个阳性克隆遴行了全序列的克隆和进一。 步的功能分析。通过基于阉源重组获得单交挟突变体后，对单交换突变体染色体总DNA进行酶 kb： 切、臼连、转化筛选阳性克隆重组质粒豹方法，分别得到了含有上F游未知序列的s4克隧1l 7 kb；$64兜隆13kb和$65(挂Ⅱ肪uE)克隆15．7kb。其中，$65(却 $35(即or935)克隆10．6 kD)。 乃uE)克隆已证明与铁转运有关。$35(即or935)克隆的编码蛋向为736个氨基酸(78．4 序列比较分静亍表明，Or邸5蛋向可分成3个独立的结构域：N端PAS结构域，中间区卵氨酸 激酶结构域(HPK)和C端响应调节蛋向结构域(RR)，同源比对结果显示它是一个禽有PAS结 构域的杂合般组分调带系统，这是在巴硬崮氮螺菌中首次发现的杂合擞绍分系统。为了确定Or935 蛋自中哪～个结构域与NifA蛋白有赢接的相互作用，构建了包括PAS结构域的全KD棚j基因， 杂交实验结果证明Or935与NifA之间的相互作用是由PAS结构介导的，这…结巢与国外报道的 PAS结构域介导蛋白与蛋白之闻的相互作闻相。致。在Abrasilense Sp7中，NifA蚩向由二二个结 构域组成：N端的调节区域，中间的催化区域和C端的与DNA结合区域。为了进…步研究NifA 区域共转化酵母细胞确定蛋白间的相互作用，结果显示NifA的N蛹介导了NifA蛋白与Or935 蛋白间韵相互作婿。即酵母双杂交系统结果表明or935蛋白的PAS结构域羊¨NifA蛋向的N端隧 域介导了蛋翻闯的相互作削。 PAS区域缺火插入壮观 对or935进一步的功能研究中，构建了$35克隆PAS区域缺失年¨35 霉素抗性片段的同源重组突变体，研究了PAS缺失插入双交换突变体的的趋能性，环境网子(铵 和氧)对其围氮活性的影响作用和对n／t孵V，神旌基因的表达调控作用；并分析探讨了Or935蚩矗 辅因子的结合情况和o,x35基因的启动子区域。实验结果表明Or935蛋白对内胃，柚q基因的表 达有调控作用，or935突变体并没有解除铵和氧的抑制作用，但萁嗣氮酶活性和岫凹的表达擘均 较野生型岗，推测它可能作为一种负调控蛋白作用NifA蛋自两影响围氨作用。 同时，本研究构建了$64克隆的PAS区域完全缺失插入抗性片段的突变体，弗裙步探讨_『其 对环境因子(主要是铵和氧)的感应和传导作用。本研究内容为进一步揭示NIfA蛋自在同氮调控 中的作用机制奠定了基础。 关键词：巴西阉氮螺菌，酵母双杂交系统，NifA蛋白，基因克隆，固氮调控 Abstraet brasilenaeisa rhizo