植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增一座谈讲座.pptVIP

植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增; 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去， 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外， 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。; 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑 制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物 质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA 分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种 有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4- 10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂 类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体 的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 ;二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1. 材料：水稻幼苗 2. 试剂： ① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巯 基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巯基乙醇， 加双蒸水(ddH2O)定容到100ml； ② 氯仿:异戊醇(24:1) ③ 洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙??和0.077g 乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④ 无水乙醇、70%乙醇； ⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0;2、 RAPD技术在生产上的应用-杂交水稻种子纯度的鉴定(RAPD 扩增);2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态 性)。4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态 性)。5. 微卫星DNA (Microsatellite Repeats) 也称为简单串联重复序列 (Simple Sequence Repeat简称SSR)。6.小卫星DNA(MinisaTel-lte DNA)也 称为数目可变串联重复序列(Variable Numbe of Tandem Repeat简称 VNYR)。 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)是 1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导 的两个小组几乎同时发展起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一 个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大 小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性。; DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存 在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。 由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之 间，它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，用 各自DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引 物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼 脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即 可直接看到这种差异，这就是RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴 定的工作原理。 PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个区域而 进行的重复双向DNA合成。