细胞杀伤力曲线测定.docVIP

2012-10-10 DMEM/F12培养基配制 gibco D-MEM/F-12 CAT.NO.12500-062 LOT.NO.1206536 干粉培养基，每包装配1L。 直接溶于1L纯净水中，加2.438g碳酸氢钠，搅拌2小时，pH试纸检测中性。 0.22μm滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。 5瓶180ml，1瓶不到180ml。 其中1瓶180ml培养基加入FBS 20ml。 2012-10-11 CHO-S细胞复苏： 41℃迅速溶解1min； 2ml细胞液+6ml DMEM/F12 10%FBS加入离心管，轻柔吹散。 离心1000rpm 5min； 弃上清； 加入3ml DMEM/F12 10%FBS，轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶，补3ml DMEM/F12 10%FBS； 轻柔混匀，镜下观察，细胞密度85%-90%，细胞呈圆形悬浮； 37℃ CO2培养； 2012-10-12 细胞观察： 贴壁，90%密度； 95%呈圆形，少量有梭型倾向，密度过高，决定传代； 细胞传代：13:00 弃上清； 加入胰酶，2滴管（37℃回温）； 室温显微镜下观察，有微量脱落，1min； 倒出胰酶，加入5ml DMEM/F12 10%FBS，9区吹扫程序3次； 1传2，补2.5ml DMEM/F12 10%FBS； 原瓶中还有未脱落细胞，又加入5ml DMEM/F12 10%FBS继续培养，胶布标记。 2012-10-13 观察细胞状态： 贴壁，有少量呈梭型，大部分为原型，但并不圆润。 2012-10-15 观察细胞： 大部分为梭型，少量为原型，约80%，培养基开始变浅。 细胞传代： 两瓶量多的1传2； 2012-10-16 观察细胞： 传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察，成团状生长，有展开细胞。 换培养液：13:00 未脱落细胞换液，生长良好。 配PBS: NaCL 1.6g, KCL 0.04g, KH2PO4 0.04g, Na2HPO4.12H2O 0.726g, H2O 200ml, 高压灭菌。 2012-10-17 胰酶消化分散传代： PBS清洗2遍； 胰酶侵润，立即倾倒或保持； 显微镜下观察1min； 加入5ml培养基； 吹扫分散，1传2； 2012-10-18 细胞观察： 尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁，我怀疑是第一次做的时候胰酶消化的时间过长，损伤了细胞壁；（需要严格控制消化时间，尤其注意，胰酶在倒出后，应立即加入终止培养基。） 我传代的6瓶贴壁生长正常，但还是有团块生长；（这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致，并不是第二次传代可以吹散的，计划降低接种比例，延长生长时间，逐步减少团块数量。） 2012-10-19 配制胰酶： life science进口分装胰酶； 0.25%，100mlPBS溶解； 0.22μm过滤； 冻存液配制： 5%DMSO，250μLDMSO，4750μL含血清培养基。 细胞冻存： 选密度较高，展开细胞较多，团块较少的4瓶细胞消化冻存； 倒掉培养基； 2ml胰酶，室温60秒静置； 倒掉胰酶； 加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次； 1000rpm离心5min； 倒掉上清； 加入冻存液； 立即放入4℃，1h； -20℃，3h； 液氮口过夜； 装入液氮存储核； 6B41\6B42\6B34\6B22 其中有一只冻存管细胞较少，已标明。 细胞传代： 一瓶1传2； 一瓶1:4传代。 （新配的胰酶很好用，细胞容易打散） 2012-10-20 尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液，去除死细胞 2012-10-21 细胞观察： 1:4传代的一瓶（原瓶）培养基变黄，细胞贴壁展开非常好，比其他几瓶都好，未见染菌。推测细胞展开良好，没有接触抑制，代谢旺盛，生长迅速。建议立即换液。 细胞换液： 1:4传代的一瓶（原瓶） 2012-10-22 细胞观察： 前日培养基颜色变化很大的一瓶细胞，换液过夜后颜色变化依然很大，并且细胞形态由展开向收缩发展，决定放弃。 细胞传代： 取三瓶细胞形态较好的1:4传代；共传6瓶，计划4瓶冻存，2瓶用于DNA提取； 使用吸管吹散，细胞分离不完全，见2-8个聚集。 培养基配制： 从马格非分装血清中分出80ml，其中20ml加入180ml培养基中待用，60ml储存。 细胞复苏： 尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。 2012-10-24 细胞观察： 22日1:4传代细胞有聚集有展开，不是最佳状态，可能不适于冻存，原因可能是上次用吸管吹的力度比较小，为完全吹散； 按照罗成的建议可以适当这延长消化时间，尽量减少吹打的损伤； 胰酶消化和枪吹散哪种更损伤细胞？