聚合酶链式反应PCR-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.12.5.3 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature): 目的双链DNA 片段在 94 ℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50 ℃左右)下与模 板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在 Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下, 以目的 DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理 论上每一轮循环将使目的 DNA 扩增一倍（图 4 ）,这些经合成产生的 DNA 又可 作为下一轮循环的模板,所以经 25-35 轮循环就可使 DNA 扩增达 106 倍。 一、 PCR 反应中的主要成份 1. 引物：PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往 往是 PCR 成败的关键。引物设计和选择目的 DNA 序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为 16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中 G+C 含量通常为 40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm ＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱 基应随机分布，在 3端不存在连续 3 个 G 或 C, 因这样易导致错误引发。(4) 引物 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密 码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在 3端应不存在二级结构。(6) 两引 物之间尤其在 3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不 存在 4 个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物 5端对扩增特异性影响不大, 可 在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突 变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在 5端限制酶位点外再加 1-2 个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳 定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程 度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的 Met, 3端应不存在简并性。否则可能 由于产量低而看不见扩增产物。 一般 PCR 反应中的引物终浓度为 0.2-1.0μmol/L 。引物过多会产生错误引导或产 生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在 1cm 光程比色杯中,260nm 下,引物浓度可按下式计算： 中国试剂网 3.12.5.3 X mol/L ＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中 4 种不同碱基个数。 2. 4 种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) ：dNTP 应用 NaOH 将 pH 调至 7.0,并用分 光光度计测定其准确浓度.dNTP 原液可配成 5-10mmol/L 并分装,-20℃贮存。一般 反应中每种 dNTP 的终浓度为 20-200μmol/L 。理论上 4 种 dNTP 各 20μmol/L, 足以在 100μl 反应中合成 2.6μg 的DNA 。当dNTP 终浓度大于 50mmol/L 时可抑 制 Taq DNA 聚合酶