农杆菌介导水稻快速转化-bio-protocol.pdf

/e1010176 DOI:10.21769/BioProtoc.1010176 农杆菌介导水稻快速转化 崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：hchen@ 引用格式：崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. 实验原理：Toki 等(2006)发现，水稻成熟胚在诱导愈伤1 d 后可以被农杆菌侵染，诱导 愈伤5 d 后可以被高效转化。Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下，水稻愈伤组 织可以快速分裂。在该条件下进行筛选培养，14 d 可以得到明显的抗性愈伤组织。 本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上，参考 Toki 等(1997，2006)发表 的部分实验参数，建立快速的水稻转化方法，以缩短遗传转化周期。本实验在32 °C、 光照条件下诱导愈伤，对诱导5 d 的水稻愈伤组织进行侵染，随后在32 °C、光照条件 下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养，14 d 后获得了抗性愈伤组织，对抗性愈伤组织进 行分化培养，获得稳定的转化植株。从愈伤组织诱导到转化再生植株生根，整个实验周 期约为50 d 。 关键词：水稻成熟胚，农杆菌介导，快速转化 材料与试剂 1. 滤纸 2. 水稻种子 3. 75%酒精 4. 吐温20 5. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体) 6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408) 7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753) 8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640) 9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886) Copyright © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010176 DOI:10.21769/BioProtoc.1010176 10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299) 11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924) 12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642) 13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469) 14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001) 15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765) 16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666) 17. Thiamine HCl (VB ) (Sigma, catalog number: T-3902) 1 18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011) 19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169) 20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879) 21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG) 22. Agar powder ( 日本分装，catalog number: BM0212) 23. Glycine ( 日本分装，catalog number: BA0802) 24. Proline (进口分装，c