实验七番茄果实大小进化中的数量遗传的基因鉴定.pdfVIP

实验七、番茄果实大小进化中 的数量遗传的基因鉴定 一、实验目的 1、了解番茄在进化过程中，果实大小的变化及 分子原理基础； 2、学习、掌握从植物组织中提取基因组DNA的 方法，原理； 3、通过PCR法，鉴定出番茄大小差异的数量性 状遗传基因座（QTL ）中的基因 二、实验原理 数量性状遗传： 番茄大小进化： 番茄数量基因性状座fw2.2 和fasciated 番茄大小进化：属于数量性状遗传 A B C fw 2.2 fasciated 图1 番茄驯养过程中的果实大小变化。A 是接近野生型品种S. pimpinellifolium； B是中等大小的突变体番茄；C是目前市场销售的最大的番茄突变品种。从A到B过程仅增 加了细胞分裂数，而心室器官数量没增加；B到C过程是果实小室数量的增加。 番茄数量基因性状座(QTL) ：fw2.2 番茄数量基因性状座(QTL) ：fw2.2 位于第二号染色体上，位点基因为：ORFX 基因； 三个外含子，能编码一段含有163 个氨基酸的肽 链； 影响心皮细胞分裂的数量，形成心皮厚薄； 负调控因子，影响效应的30% 番茄数量基因性状座(QTL) ：fasciated 番茄数量基因性状座(QTL) ：fasciated 位于11号染色体，其等位基因为：fas fas 基因由6个外显子组成； 影响心室的数量，从而调控番茄果实大小； 负调控因子，调控效应为50%左右； 调控方式：fas基因第一个内含子插入6-8kb的片 段 本次实验的设计：验证是否有插入序列 大 小 tom52 （大）tom52 （小） 三、实验材料 裂解液：2%月桂酰基肌胺酸钠，50mM Tris/Hcl,25mM EDTA,pH 7.5 酚氯仿溶液 3M醋酸钠溶液 无水乙醇 70%乙醇 三、实验步骤 1、番茄叶子基因组DNA的提取： 1）、取一个叶片用水冲洗干净，用滤纸吸水晾干（每 小组做一份大小番茄）； 2）、置于1.5ml EP离心管中,加入300ul裂解液，用组织 研磨棒研磨成浆；再加入300ul裂解液，一边加一边冲洗研 磨棒； 3）、加600μl酚/氯仿溶液，在votex（振荡器）上充分 混匀； 三、实验步骤 4）、12000 rpm离心5min后，小心吸取上清至新离心 管中； 5）、分别加入1/10体积3M NaAc(pH5.8)和等体积预 冷的异丙醇于新离心管中，轻轻混匀(上下颠倒约10次)， -20℃放置20 min； 6）、12000 rpm离心5 min，弃上清； 三、实验步骤 7）、用70%乙醇洗涤沉淀，倒置晾干； 8）、加入25μl TER溶液，37℃放置10min以溶解DNA沉淀； 注意事项 1、微量移液器的使用，做到 准确加量； a ）注意移液器的量程范围，在有效的范围内 操作，减小误差 b）吸取液体时候，推至档位一，转移时推至 档位二 c ）使用完毕，将移液器调至最大量程 注意事项 2、组织研磨棒不可大小番茄混用， 大小番茄的研磨棒分开，避免大小 番茄基因组DNA交叉污染 注意事项 3、加酚氯仿的时候， 先来回吸打后，再吸取600ul酚氯仿， 并盖紧离心管盖子。 注意事项 4、加入异丙醇沉淀后，要轻轻混匀 （上下颠倒10次），不可剧烈震荡。 注意事项 5、70%乙醇洗涤沉淀后， 要晾干，彻底除掉残余乙醇， 以免影响后续实验。 大约需要晾干5-