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Gene Diagnosis;nucleus;第一节 基因诊断的基础;基因诊断的特点 ;核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术 核酸分子杂交可进行基因的特异的特异识别和分析。 PCR 可进行已知序列或已知部分序列基因的检测。 ;第一节 基因诊断的基础;1.制备合适的探针 是核酸杂交用于基因诊断的关键 What is a probe? 标记的已知序列核酸片段，包括 DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide;1.制备合适的探针 选择探针的原则： 致病微生物核酸中最保守、最特异的序列 突变基因中含突变位点或突变区的序列 待测基因编码的mRNA序列等;2.不同形式的核酸分子杂交;;第一节 基因诊断的基础; 为适应DNA诊断的需要，除上述常规PCR外，又逐步发展了不同目的特殊类型的PCR技术： （1）??? 长片段PCR（long fragment PCR） （2）??? 锚定PCR（anchored PCR） （3）??? 嵌套式PCR（nesting PCR） （4）??? 多重PCR（multiplex PCR） （5） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） （6）??? 不对称PCR（asymmertric PCR） （7）??? 反向PCR（inverse PCR） （8）??? 原位PCR（in situ PCR） （9）??? 定量PCR（quantitative PCR） (10) 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）;（二） PCR技术;（二） PCR技术;（二） PCR技术; PCR及其衍生技术 4. PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP) 将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。 1）单链核酸碱基-构象-电泳速率 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;PCR-SSCP分析原理示意; PCR及其衍生技术 5. PCR-变性梯度凝胶电泳分析（PCR-DGGE） Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; PCR及其衍生技术 7. 甲基化特异性PCR Methylation specific PCR, MS-PCR 模板甲基化处理：Na2SO3 C-U 需设计特异性甲基化引物G:C/A:U; 3’ GGACGTAGA5’ 非甲基化引物 5’---CCTGCATCT------- GCGCTAGGC----3’ 3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’ 5’GCGCATGGC 3’; 3’ GGACGTAGA5’ 5’---CCTGCmATCT------- GCGCTAGGC----3’ 3’---GGACGTAGA ------- CGCGATCmCmG---5’ 5’GCGCATGGC 3’; PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析 Q-PCR, Quantitative PCR 基本原理：PCR指数扩增规律 N=N0(1+E）n ; PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析 （1）测定PCR产物量： 梯度（系列）稀释法：先对已知量的靶 DNA进行梯度稀释（类似于比色） 灰度扫描法 ; PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析 （2）极限稀释法 基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数