分泌型表达载体——基因工程技术讲解与应用.ppt

分泌型表达载体 ----基因工程技术与应用 北京理工大学生命学院 ATG 信号序列 插入位点 终止子 分泌型表达载体 信号肽 分泌型表达载体——原核 原核常用的信号肽： 碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽 pTA1529 ----phoA (碱性磷酸酶) pINⅢ系统---- ompa（外膜蛋白) PEZZ18----蛋白A 分泌型表达载体 pTA1529 大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。 在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。 由周质信号肽酶切下信号肽。 pINIII系统 D下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 pINIII-A1：plasmid ds-DNA 7400 BP pINIII-A2：plasmid ds-DNA 8900 BP pINIII-A3：plasmid ds-DNA 7400 BP Ipp（脂蛋白基因）启动子 Tac启动子 ：IPTG诱导转录。 信号肽序列：大肠杆菌中分泌蛋白外膜蛋白(ompa) ； EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ lac阻遏子的基因（lacI）  pEZZ18 Plac：Lac启动子 Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子 S：蛋白A的信号肽序列 两个合成的Z功能域 （结合lgG ，琼脂糖层析柱）2 分泌型表达载体——真核 酵母常用 信号肽序列：α因子、酸性磷酸酶（PHO5)、蔗糖酶（SUC2）等的信号肽。 α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面的一段由Lys-Arg (Glu-Ala)l-2或Lys-Arg-Glu-Ala-Asp-Ala氨基酸序列组成的问隔肽。膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别Lys-Arg C端，STEl3基因产物则识别(Glu-Ala)l一2或Asp-Ala外侧。 常用的分泌表达载体有： pPIC9K、pPICZα、pGAPZα系列——α因子 分泌型表达载体——真核 PGAP甘油醛三磷酸脱氢酶 启动子：组成型表达启动子 S MCS 毕赤酵母表达载体pGAPHα的构建 组成型启动子 GAP启动子 pPIC9上的甲醇 诱导型启动子AOX 毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建 里氏木霉木聚糖酶基因xyn2 为报告基因 克鲁维酵母菊粉酶基因 信号肽INU a—Factor信号肽 借助计算机设计，人工合成信号肽序列：按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I，随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入1～10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸，构成10种不同的分泌信号肽序列。 在MF α中间插入EEAAEAEPK共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高。 KEX和STEl3基因产物有时候会产生信号肽切割不完全，使一些分泌的蛋白N端带有(Glu-Ala)l-2融合序列。通过设计引物去掉(Glu-Ala)1-2两个重复单位。 利用分泌增强子增强外源蛋白的分泌。利用人白介素-1β(hIL-1β)作为分泌增强子。 改造分泌信号 Thanks 简化发酵后处理，使形成正确构象，避免在细胞内讲解 * SD序列即位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。 * * 含有Sh bler基因，它的表达产物可以对抗生素eocin产生抗性，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选。而且在大肠杆菌与毕赤酵母中均可用作选择标记 pBAce 碱性磷酸酶alkaline phosphatase ALP AKP * 为了使不同密码子读码框正确衔接，合成了适用于三种密码子读码框的多克隆位点 带有大肠杆菌最强的启动子之一——Ipp（脂蛋白基因）启动子。脂蛋白为细胞外膜蛋白，该启动子表达效率高。 Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该启动子只需用IPTG诱导转录即可。 * 来自金黄色葡萄球菌的蛋白A具有与抗体lgG结合的能力，Z功能域是根据蛋白A中结合lgG的B功能域而设计的。融合蛋白表达后，在信号序列的指导下，分泌到培养基中。然后用固定了lgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域结合而得到纯化的融合蛋白。而这个14kDa的ZZ肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。 用重组ＤＮＡ技术在大肠杆菌中克隆并表达了金黄色葡萄球菌Ａ蛋白ＳｐＡ。在Ｅ。ｃｏｌｉ