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实验操作注意事项 RNA提取 PCR产物回收 感受态细胞的制备（氯化钙法） 连接 转化 转化菌质粒的提取 RNA提取 提取RNA所用的耗材如枪头、离心管等要用DEPC水浸泡过夜，灭菌时要30min 1）取20ml左右对数生长期的盐藻细胞液（107数量级细胞，太多，细胞裂解不完全，会有DNA，太少，RNA量不足），8000g离心2min（温度不宜太低，否则会产生盐沉淀），弃上清，收集细胞； 2）加入1mlRNATM plus，用移液器吹打重悬，重复混匀至无明显沉底，转入1.5ml离心管中，室温静置5min。注：RNATM plus具有腐蚀作用，并且吸入有害，小心使用。 3）向上述裂解液中加入200ul氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化（无分相现象）后，室温静置5min。（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开） 4）12,000g4℃离心15min（此时溶液分为三层，即：上层为透明的水层，RNA溶解在此层中；半固体状的中间层，此层中包含DNA；另外有黄色的有机溶剂下层，蛋白质、多糖等物质溶解在此层），取上清液（约600ul）移入另一新的离心管中（谨慎操作，防止吸入白色中间层）。 5）向上述溶液中加入120ul氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，室温静置5min。（再次抽滤，保证蛋白质的去除） 6）12,000g4℃离心15min，取上清液（约450ul）移入另一新的离心管中。 7）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，于15~30℃下静置10min。 8）12,000g4℃离心10min。离心结束后，试管底部会出现RNA沉淀。 9)弃上清液，缓慢沿管壁加入75%乙醇1ml（用DEPC处理水配制，切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。 10）12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇。（为避免影响后续操作，应尽量除去乙醇） 11)室温干燥沉淀2~5min（切勿离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。RNA溶解时，很容易降解。最后一步溶解很关键，溶解后需分装 PCR产物回收 准备：75℃水浴；检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70℃温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。 1）在紫外灯下切下含有相应DNA片段的琼脂糖凝胶，吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100uL体积）。经验值是小孔是4个孔约为200mg，中孔是3个孔约为200mg，大孔是2个孔约为200mg。 2）加入三个凝胶体积的Buffer DE-A（一般是600ul），混合均匀后于75℃加热，每2-3min混合一次，直至凝胶块完全熔化（熔化不完全会造成阻塞回收柱，DNA片段的回收率低，甚至会收不到目的片段。切胶时尽量切碎）。 感受态细胞的制备（氯化钙法） 准备工作：灭菌：0.1mol/L CaCl2、80%甘油、2个40mlLB液体培养基（250ml锥形瓶，方便摇菌 ）、2个5ml液体培养基、一个不含青霉素的LB固体平板、2个40ml离心管、滤纸、5ml枪头 第一天 1）将大肠杆菌DH5α菌株接种于LB固体培养基中，倒置37℃过夜培养（12-16h）。（活化细胞制感受态时，培养基不加抗生素。没有抗生素，细菌长得比较快，可适当缩短培养时间） 第二天 2）用接种环挑取一个DH5α单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，190rpm振荡培养过夜。（12h即可） 第三天 （打冰） 3）将1mL菌液全部转接到一个含有40mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃，210-250r/min振荡培养2小时。 4）将菌液转移到40mL离心管中，冰上放置10min以抑制菌生长。（此时打开离心机预冷，将0.1mol/L CaCl2、80%甘油放在冰上预冷） 4℃，4000 r/min离心10min，回收细胞。倒出培养液，将管倒置在灭菌滤纸上1min，以便使培养液流尽 5）加入预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮沉淀（轻轻吹打，使菌液均匀），立即放在冰上保温30min，使其低渗。4℃ 4 000r/min离心10min，回收细胞。 6）用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）。 7）分装细胞，每200μL感受态细胞一份，并分别加入终浓度10-15%甘油，-80℃贮存。 连接 10uL的反应体系： pMD18-T Vector（取出放置冰上）1uL 回收的PCR产物 4uL SolutionΙ 5u