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1＃ 2＃ 3＃ 6＃ pUC18 pGFPuv 挑取单菌落，接种于5mLLBA培养基中。 37℃过夜培养。 按1:100接种 对照 IPTG+Glc IPTG 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ 1＃ 2＃ 3＃ 4＃ 5＃ 25 ℃ -28℃培养过夜 5000rpm离心，收菌体 取5mL离心 其余离心收菌体，提取蛋白 注意事项 本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。 6#瓶仅加IPTG 。 不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。 本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。 实验安排 第一天： 上午配试剂，灭菌； 下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导。（步骤2、3） 第二天： 收菌、紫外观察结果和拍照； 破碎细菌，分离上清，待过柱。 思考与讨论 对紫外灯下观察到的结果作出解释。 为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？ 大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？ 实验十二 金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质 实验目的 实验原理 材料与试剂 实验仪器 操作步骤 注意事项 实验安排 思考与讨论 一．实验目的 学习亲和层析的原理。 掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。 实验原理 以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。 蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。 过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。 金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 材料与试剂 材料 含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。 试剂 0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液 50mL 2mol/L NaCl 溶液 50mL 1mol/L NaOH溶液 50mL 0.2mol/L NiSO4溶液 30mL 起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mL Chelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL 大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL 洗涤液：50mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0 洗脱液：300mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl，pH7.0 实验仪器 1.5cm X 50cm层析柱、自动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。 操作步骤 样品的制备: 细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在25℃培养的细胞培养液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为400W，工作4秒，间隙4 秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期。然后8000r/min,离心30min，取上清液。放冰箱备用。 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下