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PCR (Polymerase Chain Reaction) 目 的： 熟悉PCR技术的基本原理和操作 (一) 组织处理： 取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面血液，每克肝脏加2ml的裂解液，匀浆器中匀浆 PCR反应 （一） 引物： 5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’ 5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’ 引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件 核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版 + Taq DNA聚合酶 　 0.55 ?l 程序设置： 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 35个循环 （一般在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒） 反应结束后加中止液10 ?l （三）扩增结果：220-242 bp 对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃ 注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计 2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出 3、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除 6、电泳前，确认样品孔位于电场负极 7、因EB存在，全部操作过程要带防护手套 * 聚合酶链反应 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10.000$ 1993 Nobel prize 历 史 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 PCR过程 PCR引物设计 一对引物，分别与5 ′和3′端互补 长度：15～30个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 PCR反应体系的五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校读功能 PCR反应体系的准备 + primers + nucleotides +Taq polymerase (Thermus aquaticus ) + salts (ions) + DNA fragment TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA Step 1 : Denaturation 变性 94°C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA Step 2 : Annealing 退火 T° primer-dependent CGTAGTAGCA GCTGCTACGTAG TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA Step3 : Extension 延伸 72