林木育种试验实习指导-林学类试验教学示范中心.DOCVIP

实验一 花粉的生命力测定 一、 掌握用间接法测定花粉生命力的方法，了解其原理。 二、 烧杯、载玻片、盖玻片、解剖针、毛笔、标签、玻璃铅笔、显微镜、测微尺、培养皿、蔗糖、琼脂、联苯胺、α－萘酚、碳酸钠、30%过氧化氢等 三、 油茶、茶叶、枇杷等树种以及各种花卉的新鲜花粉；杉木、马尾松等树种的贮藏花粉。 四、 在使用经贮藏或外地来的花粉时，为保证杂交工作的成功，应预先进行花粉生命力的测定，如花粉的生命力已丧失或只有极弱的生命力时（发芽率在5%），就不能用于杂交，否则必遭失败，花粉生命力的测定是杂交工作中的重要一环。 测定花粉生命力的方法可分为直接法和间接法二类，前者是指把花粉直接受在同种植物的雌蕊上，以后观察果实发育情况或通过解剖，检查花粉的发芽情况，以确定花粉生命力，后者又有两种方法，即培养基法和染色法，本实验就是用染色法。 五、 （一） 把花粉播种在特定的培养基上，置于适当的温湿条件下，使之发芽，以鉴定花粉生命力，常用的培养基是由蔗糖、琼脂和蒸馏水配制而成，不同的树种花粉，对糖浓度要求不同，培养基的pH值一般调整到6-5.2之初是，如果在培养基上加入少量的硼酸和维生素B1，更利于花粉发芽。 1、固体培养基的配制 在100ml蒸馏水中，加入1-2g琼脂，置烧杯中，隔水加热，煮开，使琼脂溶解（加热过程中用培养皿盖在烧杯上，以防水分蒸发丧失），然后加入10-15%蔗糖，溶解后即为10-15%糖浓度的蔗糖琼脂培养基。 趁热及滴管吸取培养基液（或直接手玻棒）滴1-2滴于载玻片的槽内，冷却后即成固体培养基。 2、播种花粉 用解剖针粘取少量花粉，均匀地撒在培养基上，也可用小棉花球粘取少量花粉，用口轻轻一吹，使花粉均匀播洒在培养基上，播种花粉量不能太多，以每一视野（10×10）中的均匀分布100-200粒左右的花粉为宜，播种成团的，或数量过多的，必须重做，否则发芽后难以计数。 3、培养 以播好的载玻片置于或垫有湿润吸水纸的培养皿中，盖上培养皿以保湿，放在20-25℃的恒温箱中培养24小时或更长时间（不同的花粉培养时间不一样，应隔不同的时间在显微镜下连续检查花粉发芽情况，直至花粉发芽粒数不再增加为止，花粉发芽的标准是花粉管伸长超过花粉直径为准）。 4、? 观察 在显微镜下，随机取5个视野，计数花粉总数及发芽的花粉数，填入表1，算出发芽率，然后随机测定10个花粉管的长度，算出平均长度。 （二）染色法（生物化学法） 染色法是借助于测定花粉的过氧化物酶的活性强弱来测定花粉生命力的方法，在活花粉内存在过氧化氢酶，它可以使H2O2放氧分解。其放出的活性氧使还原剂氧化。本实验用无色的联苯胺和α－萘酚作为还原剂，它们被氧化后都表现出红色或玫瑰红色，花粉中过氧化氢酶的活性大小同红色的深浅成相正关，如果花粉是死的，则这一反应不能进行，花粉保持原色。 1、配制药液 A、甲液的配制 （1）　取0.2g联苯胺溶于100ml　50%的酒精中，盛于棕色瓶中，置黑暗处。 （2）　取0.115gα－萘酚溶于100ml　l50%的酒精中，盛于棕色瓶中，置黑暗处。 （3）　取0.23g碳酸钠溶于100ml水中，盛于白色瓶中。 （4）　以上3种溶液等量混合，配成“甲液”，盛于棕色瓶中，置黑暗处。 B、乙液的配制： 将30%过氧化氢临用前稀释至0.3%即为乙液。 2、制片 取少量花粉放在悬滴载玻片的点槽马尾，滴入一滴甲液，置片刻后，再滴一滴乙液，3-4分钟后观察。 3、结果观察： 在显微镜下观察，凡变成红色或玫瑰红色者为有生命力花粉，不变色者为无生命力花粉，随机观察5个视野计数，有、无生命力的花粉数，填入表2。算出有生命力花粉的百分率。 七、作业： 1、汇总花粉生命力测定计算结果 2、绘制花粉发芽形态图（注明放大倍数）。 3、分析花粉发芽率高低的原因。 4、比较两种测定方法的结果，分析其原因。 附表：记载： ①树种　②花粉采取日期　③花粉采收方法　④贮藏方法　⑤测定日期　⑥测定结果 附表1　发芽法　　　　　　　　　　　　　　　　　显微镜倍数 视野中花粉情况 载玻片号 树种 培养基 刺激物 1　2　3　4　5　合计 发芽率（%） 花粉管平均长（u) 发芽数/总数 　　　　　　　　　　　　　 附表2，染色法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　显微镜倍数 视野中花粉情况 载玻片号 树种 1　2　3　4　5　合计 有生命力花粉百分率 发芽数/总数 实验二 树木杂交 一、实验目的：掌握植物人工杂交技术 二、实验用具：修枝剪、纸袋、细绳、棉花、标签、毛笔、镊子、解剖剪力，授粉器、75%酒精 三、实验材料：油茶、茶、各种适花期花卉等 四、实验说明： 杂交就是把遗传基础不同的种，或同一种不同的类型或个体进行人工交配，获得杂种的过程，有性杂交是引起生物体产生遗传变异的原因之一，通过杂交获得