动物细胞工程指导-国家级生物学教学中心-江苏师范大学.doc

细胞工程实验指导 (本科生用) 陈 宏 房兴堂 编著 江苏师范大学 二○一三年九月 目 录 第一部分 实验室规章制度……………………………………………1 学生实验守则……………………………………………………………1 实验室安全管理制度……………………………………………………1 第二部分 细胞工程基本技术 实验二、 小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测 与结构观察…………………………………………………17 实验三、 小鼠输卵管卵母细胞采集与结构观察……………………20 实验四、小鼠发育胚胎观小鼠胚胎体外培养小鼠胚胎观察胚胎体外培养小鼠第二部分??细胞工程基本实验室技术NaOH溶液浸泡过夜，流水冲洗数小时，然后用1%稀盐酸浸泡数小时，流水冲洗数小时，最后用蒸馏水漂洗3次，多重蒸馏水或去离子水漂洗2次，晾干后备用。 新的金属器皿用热洗涤剂溶液洗净，再用清水冲洗，擦干即可。 培养器皿已受微生物污染时，先用高压蒸汽灭菌后清洗。需重复使用的除菌滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，硫酸抽滤清洗，再用清水冲洗，之后用蒸馏水连续抽滤冲洗，最后用多重蒸馏水连续抽滤冲洗，烘干备用。 应以耐酸、耐热、开口较大的容器盛装洗液。可根据需要选用不同强度的洗液（表2－1），配制洗液的方法是：①按照上述配方，将需要量的重铬酸钾和蒸馏水加到选用的容器内；②向容器内缓慢、分次加入浓硫酸(工业硫酸即可)，轻轻搅拌溶液，以加快散热及促进重铬酸钾溶解。加入浓硫酸时切勿过急，以免液体骤热，发生危险；③自然冷却。 表2-1 洗液配方 成 分 强酸溶液 次强酸溶液 弱酸溶液 常用配方 重铬酸钾(g) 60 100 50 100 浓硫酸(mL) 800 200 100 200 蒸馏水(mL) 200 1000 1000 800 新配制的洗液呈棕红色。配制和使用洗液时，操作者须戴耐酸手套。浸酸的器具一定要晾干，以免将水分带入洗液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后取出器皿时，须小心操作，防止液体溅出，伤及操作者皮肤或衣服。将器皿从洗液中取出时，应滴干洗液。当洗液的颜色变暗、发绿或浑浊时，说明已使用过久，效力降低，应重新配制。 (二)清洗后物品的包装 洗净烘(晾)干的物品应及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品也便于消毒灭菌和贮存，同时可防止消毒灭菌后再受污染。包装常用硫酸纸、牛皮纸、纱布、棉布、锡箔纸、铝盒、饭盒、专用金属消毒筒等。包装的方式根据消毒灭菌的方法而有所不同。 对于体积较大的器皿(如大烧杯、烧瓶等)及滤器等容器，可采用局部包装的方法。把开口部分用硫酸纸及牛皮纸或棉布等两层紧密包装，包好后用棉线绳扎紧。对于较小的器皿，如培养皿、玻璃吸管、注射器、胶塞等可以用硫酸纸及牛皮纸等两层整体包装；金属器械、棉塞等可以先装入铝盒、饭盒或消毒筒中，然后用棉布全部包裹起来；手术器械、手套、工作衣等可以用布直接包裹。一般全包装物品体积不能过大，可以用线绳捆扎，但不可太紧。放有物品的铝盒、饭盒或消毒筒等的底部和四周需要有多处通气孔，盒盖或筒盖不宜过紧。多个相同容器不易辨别时，应分别注明内装用品的名称，每一容器内的用品不宜放置过多、过密。注射器的针筒和针芯要分开并一起包装。吸管包装盒的底部垫一些脱脂棉或软纸、纱布，管口放入少许脱脂棉或纱布，包装松紧适宜，以免吸管头被撞断。 二、消毒灭菌 严格的消毒灭菌对细胞与胚胎工程研究与应用工作极为重要，直接影响着整个实验能否顺利进行。 (一)消毒灭菌方法 目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法（消毒剂、抗生素）两大类。 1．干热灭菌法 是利用恒温干燥箱内120oC～150oC的高热，并保持90～120 min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。 2．湿热灭菌法 压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1 kg/cm2，维持20～30 min即可达到灭菌效果。饱和蒸汽压力与其对应的温度见表2－2。 3．射线灭菌法 利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活