牛SDS PAGE知识讲解.pptVIP

实验二 SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 【实验原理】 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 N, N’-甲叉 双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CH CH2ˉ CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH ( )n ( )n ( )m ( )m PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 【SDS基本原理】 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW = K - bm 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 分子筛效应 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.9 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 【操作方法】 １、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角线的方式旋紧螺丝帽。 5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙加入已融化的1%琼脂。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。 1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶） 将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合.将贮槽的蒸馏水倒