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二、酶的活性中心 (一)酶活性中心的概念 对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。 对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子，或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分 活性中心有两个功能部位： 结合部位：结合底物 催化部位：催化底物变成产物 (二)用于判断和确定酶活性中心的主要方法 化学修饰试剂 DFP：二异丙基磷酰氟 将DFP加到酶中，再水解，然后对水解后的肽段分离和鉴定，得到含有磷酰化丝氨酸残基的肽段，即DIP-肽。 进一步再对这种DIP肽段进行序列分析可以得出一些酶活性中心的氨基酸顺序 化学修饰试剂 TPCK： (N-对-甲苯磺酰 苯丙酰氯甲基酮） 通过使组氨酸烷化而对酶进行亲和标记。 3．X—射线晶体衍射法 x—射线晶体衍射法对于探明酶的活性中心提供了许多直接和确切的实验结果。 实验表明，大多数酶分子的极大部分非极性侧链汇集成三级结构的“骨架”，而大部分极性侧链则位于酶分子表面，这样的结构是有利于进行酶的催化反应的。 第六节 酶的作用机理 一、与酶的高效率有关的因素 1．底物与酶的“靠近” 及“定向” 提高酶反应速度的最主要方法是提高活性中心区域的底物有效浓度，即靠近 反应中的基团彼此相互严格定向 例 咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯的反应是一个双分子氨解反应. 当底物与酶的活性中心结合时，由于诱导楔合，使酶中的催化基团与结合基团 能够正确“靠近”及“定向”。使活性中心局部的底物浓度大大提高。 酶构象发生的这种改变是反应速度增大的一种很重要的原因。反应后，释放出产物，酶的构象再逆转，回到它的初始状态。 2．酶使底物分子中的敏感键发生“变形”从而促使底物中的敏感键易于破裂。 酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低产生“电子张力”，使敏感键更加敏感，更易于发生反应。 有时甚至使底物分子发生变形，使酶-底物复合物易于形成： 而且往往是酶构象发生改变的同时，底物分子也发生形变，从而形成一个互相楔合的酶-底物复合物 3. 共价催化 催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。 酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的巯基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。 4.酸碱催化 酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。 广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。 酶分子中可以作为广义酸、碱的基团 广义酸基团 广义碱基团（质子供体） （质子受体） 为什么His是最有效的酸碱催化功能团影响酸碱催化反应速度的因素有两个 第一：酸碱的强度 组氨酸咪唑基的解离常数约为6.0，说明由咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的[H+]相近，因此在接近于生物体液pH的条件下，咪唑基既可以作为质子供体又可以作为质子受体发挥催化作用。 第二：功能基供出质子或接受质子的速度 咪唑基供出或接受质子的速度十分迅速，半寿期小于10-10秒。而且，供出或接受质子的速度几乎相等。 虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要。 5. 酶活性中心是低介电区域 某些酶的活性中心穴内相对地说是非极性的，因此，酶的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下还可能排除高极性的水分子。这样有助于加速酶反应的。 水的介电数非常高。它的高极性使它在离子外形成定向的溶剂层产生自身的电场，结果就大大减弱了它所包围的离子间的静电相互作用或氢键作用。 二、某些酶的活性中心及其作用原理 （一）溶菌酶 溶菌酶[lysozyme(EC3.2.1.17)]的生物学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。 这种多糖是[N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)]的共聚物，NAG及NAM通过β-1，4糖苷键而交替排列。 溶菌酶的最适小分子底物为NAG及NAM交替的六糖，以A、B、C、D、E、F表示。 溶菌酶为具有129个氨基酸残基的单肽链蛋白质，含四对二硫键 溶菌酶的结构不很紧密，大多数极性基分布在酶的表面，而非极性基则隐藏在酶的内部，整个酶分子中有一狭长的凹穴。 实验证明，最适小分子底物与酶相结合时，正好是与酶分子中的长形凹穴相嵌。 凹穴中的Glu35及Asp52是活性中心的氨基酸残基。 溶菌酶在进行催化时有两大特点 1