生物化学蛋白质的分离纯化与鉴定.pptVIP

二、 蛋白质分子大小与形状 用化学分析法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只含有一个被测的元素原子，则可以由此计算出蛋白质的最低分子量。 真实分子量为最低分子量的n倍 有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，也可以按照这个原理测定最低分子量 二、 蛋白质分子大小与形状 当用一种半透膜将蛋白质溶液与水隔开时，溶剂分子将向蛋白质溶液中单向扩散，使溶液内的体积增加，液面升高。直到达到一定的静水压力时维持平衡。此时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压。 蛋白质的稀溶液： π：渗透压（大气压） R：气体常数 T：绝对温度 c：溶质浓度（g/L） 测定几个不同浓度的渗透压，用π/c对c作图外推到蛋白质浓度为0，得到截距，代入公式求得分子量。 要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度 装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净 二、 蛋白质分子大小与形状 由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为扩散。 利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律 测定在两个不同部位的浓度，可以计算出D值 扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其他手段结合 二、 蛋白质分子大小与形状 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，会发生沉降。 沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度；溶液的密度和粘度有关。 研究沉降作用，采用每分钟60000-80000转的高速离心机，相当于重力的500000-600000倍 利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平衡法 此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性 1.沉降速度法 把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速度。 在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，观察到界面的移动。 斯维得贝格方程 M=RTs/[(1-υρ)D] s：沉降系数；s=[dx/dt]/ω2x；把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，用S表示 υ：偏微比容；蛋白质溶于水0.74cm3/g D：扩散系数；cm2/s 二、 蛋白质分子大小与形状 2.沉降平衡法 在8000-20000r/min的离心力场中，分子颗粒发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度。 M=[2RTln(c2/c1)]/[(1-υρ)ω2(x22-x12)] c1和c2是离旋转中心x1和x2处的蛋白质浓度；只要实验测得c1和c2及υ和ρ，即可算出蛋白质的分子量。 二、 蛋白质分子大小与形状 利用凝胶过滤层析法可以把蛋白质混合物按分子大小分离开。 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径。 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的半径，称斯笃克半径。 用凝胶过滤法测定分子量时，标准样品和待测蛋白质必须具有相同的形状。 根据公式计算分子量： logM=K1-K2Ve K1、K2为常数 Ve：洗脱体积 测定方法：测得几种标准蛋白质的Ve ，并以它们的分子量对数对作图得一条直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中查出它的分子量 待测样品可以不纯 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可选用不同分离范围的凝胶。 二、 蛋白质分子大小与形状 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和分子形状无关。 SDS是一种变性剂，能够使蛋白质的肽链伸展。 SDS使多肽链带上相同的负电荷， 掩盖了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。 二、 蛋白质分子大小与形状 SDS与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状是椭圆棒状，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度约为1.8nm，长轴长度随蛋白质的分子量成正比 蛋白质SDS的迁移率与原有电荷、分子形状等无关 logM=K1-K2μR μR:相对迁移率。为：样品迁移距离/前沿迁移距离 二、 蛋白质分子大小与形状 测定几种标准单体蛋白分子量的对数值，对其μR值作图，再根据待测样品的μR，从标准曲线上查出它的分子量。 二、 蛋白质分子大小与形状 蛋白质分子的形状或构象的测定方法是X射线晶体结构分析。 测定蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可以判断蛋白质分子的形状 蛋白质的摩擦系数 f=RT/ND 理想刚性球体的摩擦系数 f/f0是蛋白质分子的摩擦比 二、 蛋白质分子大小与形状 当摩擦比大于1.0时，蛋白质分子的形状是不对