有机溶剂处理对固定化脂肪酶活性及稳定性的影响.doc

有机溶剂处理提高固定化脂肪酶活性及稳定性 祖昕 杜凯 曹方 孙玉梅* 大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034 摘 要：为提高固定化脂肪酶催化转酯化反应的活性和稳定性,采用活性炭、硅胶G和DM-130树脂吸附固定脂肪酶LVK-F100,并用甲醇、丙酮、丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷以及环己烷处理湿的固定化脂肪酶。结果表明,甲醇、正己烷和环己烷处理对固定化脂肪酶有钝化作用,而丙酮、丙醇、异丙醇和乙酸乙酯处理能显著提高固定化脂肪酶的活性。用乙酸乙酯和异丙醇处理吸附固定的脂肪酶1 h可使固定化脂肪酶活力分别提高1.70～2.25倍、半衰期延长3.2～8.4 h、催化大豆油转酯化反应延长使用2～5批。异丙醇和乙酸乙酯处理还可提高固定化脂肪酶的热稳定性。 关键词：脂肪酶;固定化;有机溶剂;活性;稳定性 中图分类号： 脂肪酶在工业上通常被用于催化有机媒介中的酯化或转酯化反应。其在有机溶剂或无溶剂系统催化植物油酯化是制备生物柴油的环境友好工艺[1]。 酶的固定化技术解决了脂肪酶在酯化或转酯化反应过程中易结块、不易回收和重复利用等问题，提高了脂肪酶的活性和稳定性[2]。吸附法固定化酶具有操作简单、成本低、空间位阻小、在有机介质中催化反应时脱附量较小、保留活性高、可再生等优点[3]。固定化脂肪酶在有机介质中的催化活性明显低于在水相介质中的催化活性,提高固定化酶在有机介质中的催化活性和稳定性具有很大的研究价值。 将游离脂肪酶溶解于某些纯的极性有机溶剂或含有少量极性有机溶剂的水溶液中可以明显提高脂肪酶的催化活性和稳定性[4-6]。采用异丙醇干燥固定化酶可明显提高固定化酶的活性和对映体选择性[7]。一般认为极性有机溶剂改变了脂肪酶分子的构象,促进了酶与底物的结合,从而提高酶的催化性能。但以极性有机溶剂处理固定化Candida Antarctica脂肪酶，未表现出酶活性和稳定性的提高[8]。 本文采用不同载体在水相环境中吸附固定化脂肪酶(国产),用纯有机溶剂处理湿的固定化脂肪酶，并采用处理的脂肪酶催化大豆油转酯化反应,考察有机溶剂处理对固定化脂肪酶的催化活性和 收稿日期: 接受日期: 基金项目:辽宁省教育厅创新团队项目(LT2011008);辽宁省科技厅辽宁省发酵工业产品工程技术研究中(辽科发200923)。 第一作者:祖昕,女,1990年出生,学士,硕士研究生在读,主要从事微生物发酵工程方面的研究E-mail:zuxin_2014@通讯联系人:孙玉梅、教授、E-mail:sunyumei62@163.com 稳定性的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 脂肪酶LVK-F100,10000 U/g,深圳市绿维康生物工程有限公司;牛血清蛋白（BSA）,美国Xiasi生物公司;20目、40目、60目活性炭,沈阳市新西试剂厂;硅胶G,青岛裕民源硅胶试剂厂深圳市红叶杰科技有限公司青岛裕民源硅胶试剂厂SUPELCO公司。 1.2 方法 1.2.1 脂肪酶的固定化 将15 g酶粉溶于300 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4,pH 7.0),于室温、200 r/min搅拌2 h后,于2680 g离心10 min,得上清液。再用磷酸缓冲液稀释上清液,制得浓度为0.05 mg/ml的脂肪酶液。分别将1 g经预处理的活性炭、硅胶G以及DM-130树脂加入30 mL上述酶液中,于30 ℃、150 r/min振荡吸附2 h后,过滤出湿固定化酶,于4 ℃放置24 h。 1.2.2 有机溶剂处理固定化脂肪酶 取上述湿固定化酶1 g置于100 mL具塞三角瓶中,加入20 mL有机溶剂,于30 ℃、150 r/min振荡处理1h,抽滤得处理过的固定化酶,于4 ℃放置24 h,测定脂肪酶活力。 选取作用效果较好的有机溶剂,按上述条件分别振荡处理0.5 h~8 h,抽滤得处理过的固定化酶,于4℃放置24 h,测定脂肪酶活力。 1.2.3 蛋白质测定 采用Bradford法[9],使用牛血清蛋白为标准蛋白。 1.2.4 固定化脂肪酶活力测定 采用改进的橄榄油乳化法[10]。向150 mL 40 g/L的聚乙二醇溶液中加入50 mL橄榄油,混合均匀制成底物乳化液。在100 mL三角瓶中加入5 mL底物乳化液和4 mL的磷酸缓冲液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4,pH 7.0),于38 ℃预热5 min,加入待测定的固定化脂肪酶,于38 ℃搅拌10 min,用10 mL 95 %的乙醇终止反应。以酚酞为指示剂,用0.025 mol/L的NaOH滴定水解产生的脂肪酸。 酶活力定义:在38 ℃、pH7.0μmol脂肪酸所