蛋白质组与蛋白质学.pptVIP

医学分子生物学Medical Molecular Biology; 从基因组学到蛋白质组学  ---人类迈入后基因组时代;结构基因组学 ;蛋白质组的含义;;蛋白质组学;蛋白质的种类、水平、修饰和构象的变化总是处于一个新陈代谢的动态过程中。 研究细胞内与某个功能有关或在某种条件下的一组蛋白质。 ;1）整体性和规模化： 蛋白质功能的发挥依赖其整体性（蛋白质群）的发挥。蛋白质组的大规模研究（主要集中在蛋白质表达模式或蛋白质组成研究）； 2）动态性和网络化： 蛋白质在机体中具有时空性，是动态的，故需要蛋白质的相互作用研究及蛋白质代谢网络研究（蛋白质功能模式）； 3）复杂性和综合技术化： 蛋白质功能发挥是极其复杂的调控过程，需要多种技术，如双向凝胶、双向层析、质谱、双杂交系统、生物芯片等技术的综合应用;蛋白质组研究常用技术;1）蛋白质的分离与分析 2）蛋白质－蛋白质相互作用的研究 3）蛋白质－核酸相互作用的研究;蛋白质组学和医学;2）致病微生物的蛋白质组研究 弓形体抗原的检测： 弓形体病是由鼠弓形体虫引起的寄生虫病。全球人口大约有30%是携带者，在欧洲是最常见的寄生虫病。大约50%母体的感染可引起新生儿先天性疾病。因此诊断及治疗越早越好。 目前要依靠血清学及PCR，而单独采用血清学如用IgG，IgM,或IgA抗体对疾病活动期敏感性不够，尤其对于妊娠或有免疫抑制的患者。潜在感染常发生在有免疫抑制的患者中。对AIDS患者来说，鼠弓形体虫是最主要的致命性脑损伤的病因。因此，能否早期诊断对治疗来说尤为关键。;3）致病菌耐药性研究 在白色念珠菌中，目前发现至少有8种CDR家族的基因可产生耐药株的表现型。且有55种基因分别表达ABC及MFS蛋白（菌内药物输出泵）。 应用2-DE、免疫检测蛋白质等技术，对这些蛋白在菌内的表达量进行分析，发现Cdrlp及CaMdrlp蛋白在耐咪唑类菌株中过量表达。 同时，对敏感性及耐药株蛋白质的2-DE图分析发现，在耐药菌中有25种蛋白质增加，有76种蛋白质减少。推测白色念株菌是通过改变染色体数目或染色体重组来调节基因的表达量，进而产生耐药性。; ;一、 分 离 纯 化;目的蛋白质的含量 提取蛋白质的材料;一、分 离 纯 化; 根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行： 1.根据溶解度 2.根据分子量 透析和超滤 平衡离心 凝胶过滤层析 ;3.根据电荷 毛细管电泳 离子交换层析 4.根据蛋白质的亲和能力 亲和层析 ;（四） 蛋白质分离纯化的条件;二、分析鉴定 ;二、分析鉴定;（二）二维凝胶电泳（2-DE)技术;二、分析鉴定;2-DE分析的基本步骤;2-DE获得的蛋白质图谱; 通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。 ; 2-DE图像分析软件包操作过程： ; （四）放射性核素标记亲和标签法;（五）蛋白质芯片技术;原理 样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（m/e）的差异确定分子量。 应用 蛋白质的序列分析 研究蛋白质的修饰;（七） 其它方法;2. 蛋白组学研究技术;分离细胞速度快，无需精巧的操作技能； 捕获细胞和剩余组织，其形态学特征保持完好，可较好地控制捕获细胞的特异性； 捕获细胞与塑料帽结合紧密， 减少了组织损失风险。 广泛应用于肿瘤研究;2.2.蛋白质的分离技术;等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度电泳。 分离原理：蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，可在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，不再移动，蛋白质分离。;1：样品制备保护 等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，样品制备应避免任何形式的蛋白质化学组成和结构修饰 2：变性电泳(通常加入尿素) 蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象 3：稳定电泳PH梯度： 固相PH梯度等电聚焦电泳（IPG-IEF)： 弱酸或弱碱的丙烯酰胺衍生物，凝聚时形成稳定PH梯度，分辨率0.001pH、上样量比较大、易于自动化、重复性好。;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直板电泳）：;2-DE的基本步骤：;优点：根