2010-11-08-酶学-1-酶学导论-最新.ppt

酶 学 第一章 绪 论 主授：袁永泽 yuan_yongze@163.com BP: 华中师范大学生命科学学院 酶的化学本质是蛋白质的现代生物化学证据： a) 高分子胶体物质,两性电解质,在电场中泳动。 b) 紫外,热,表面活性剂,重金属,酸、碱使酶失活。 c) 酶被蛋白酶水解酶降解而失活。 d) 对纯化后的或结晶的酶的分析证明酶由蛋白质或蛋白质+小分子（辅因子）组成 e) 1969年知道了RNase以后，人工合成了RNase,具有催化功能，而 且与牛胰 RNase一样。 f) 有些酶发挥作用需辅酶，但主要的仍为蛋白质，蛋白质是高效 专一的决定因素。 　　　 1970年后期发现了少数酶，除蛋白质外，还有RNA参与反应，而且RNA 必不可少。 　　例如E.coli 核糖核酸酶 P(RNaseP) ?　　1982年研究发现: ① 四膜虫rDNA有插入顺序,有的没有,有的有,且有长　 　　　有短，说明有无插入顺序与生存无关. ② 四膜虫前体rRNA在低浓度阳离子下，切去一个内 　　　含子，余下部分连成为成熟的rRNA。 　　　这种自我剪切靠自己前体rRNA。 ●　脱氧核酶（Deoxyribozyme）的发现 　　 1994年，Breaker实验室首次发现，一个小的单链DNA分子催化RNA磷酸二酯键的水解。 　　　1995年，Cuenoud实验室设计了一个长47个碱基的小分子单链DNA，催化与它互补的两个DNA片段间形成磷酸二酯键，具有连结酶活性。 半抗原诱导法（细胞融合法） ●先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)。此 偶联的物质作为抗原 ? 免疫动物，产生抗体?? 产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。? 用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶 关键：用什么样的抗原才能诱导出具有特定的酶催化功能的抗体？即由抗体向酶 的转变过程。 引入法(辅助因子）： ●是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法，将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。 ●Schultz等人在IgAMOP315抗体结合部位选择性引入巯基，然后用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高6×104倍 ●酶的活性中心很多有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键,通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连,再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达6×104。 ●吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒掉。目前，直接拮抗可卡因上瘾的抗体还没有找到。 ●替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子，然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生，必须使用高剂量的抗体,使这一应用受到限制。 ●抗体酶则不一样，不但能和抗原结合，而且能使抗原水解而再生，这不但能减少抗体酶的用量，也能减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。 Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。 （1）人工模拟酶 ?-benzyme 二、酶的分布与功能 ◆生物体自身需要决定了酶的生物合成，酶的　 　　生物合成机制决定了酶在生物体内的分布状 　　态； 　　所以： ? 不同生物体细胞内酶的数量和种类不同； ? 同一生物体内的不同部位或不同生长发育　 　　 阶段的细胞内酶的数量、种类不同。 微 生 物 酶 1、胞外酶（分泌型酶） ◆ 指可以穿过细胞质膜的任何酶，大多数是水解酶； 大多数工业用酶是胞外酶。 ◆ 优点：比胞内酶容易回收、纯化； 不必破碎细胞，也不用去核酸； 容易获得高产。 ◆ 基因工程中外源蛋白最终在周质中表达的情 况，常给工作带来许多麻烦。用基因工程手 段获得的微生物高产外源酶常会被宿主本身 的蛋白酶迅速降解。 ◆ 因此，尽可能地使产生的外源酶