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第二章 生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology ;??;二、生物活性物质常用的提取方法与优化;（二）提取方法与优化1.溶剂选择2.选择添加剂 ①保护剂； ②酶抑制剂。3.提取条件 ①温度； ②pH； ③盐； ④表面活性剂。;三．浓缩与干燥;世界上最大的具有80m2蒸发面积的薄膜蒸发器。 ;; 2.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥;;;冷冻干燥机 ;四、分离纯化;2. 分离纯化原理 (1)根据分子形状与分子大小 (2)根据电荷差异 (3)根据分子极性与溶解度大小 (4) 根据吸附特性 (5) 根据生物配基特性;3. 选择原则 （1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率。 盐析，分级沉淀，萃取，超滤。 （2）精制：高分辨率。 多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC（快速蛋白液相色谱 ），电泳或等电聚焦。 ; 第二节 微生物制药工艺技术基础一、菌种的选育与保藏;（1）平板划线法; 步骤六：重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤七：由第五步骤的第一区中划出第二区，如上图。步骤八：重复第六及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如上图。 步骤九：重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如上图。步骤十：在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、菌种学名以及培养基名称。 ;（2）稀释平板法;;2．诱变育种（p43-p48） 指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。 （1）出发菌株的选择 ①纯种菌株 ②具备优良性状的菌株 ③对诱变剂敏感 ④选择几株不同的优良菌株 （2）诱变处理: ①化学诱变②物理诱变③生物诱变④新型诱变剂 （3）筛选： ①随机筛选；②理性化筛选 ;①随机筛选：菌种经诱变处理后，进行平板分离，经培养后随机挑选单菌落，从中筛选出具有优良性状的??株。（p52）;②理性化筛选：是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。;3、现代菌种选育技术（p61-） ①杂交育种 ②原生质体融合 ③基因工程技术 ;杂交育种;原生质体融合育种; 原生质体融合 ;菌种保藏（p56、110）;（4）菌种保藏方法： ①斜面保藏法 ②液体石蜡保藏法 ③沙土管保藏法 ④麸皮保藏法 ⑤冷冻干燥保藏法 ⑥液氮超低温保藏法 ⑦甘油保藏法 ⑧孢子滤纸保藏法; 第三节 生物技术药物制造技术基础?一、重组DNA技术原理;2．基因工程药物制造过程 ;二、基因工程主要操作技术;（1）cDNA文库;目的基因的获得：cDNA文库;（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR） ;;;（3）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。;2．DNA重组体的构建 根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector） （1）E.coli：质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。 （2）芽孢杆菌：pUB110 pE194和pC194 （3）链霉菌：pIJ101 pSG5 cDNA与载体连接方法 ①同聚尾连接法 ②人工接头连接法;质粒载体PBR322;; 头部;3．重组体的表达系统 （1）原核表达系统 ①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met（AUG），有内毒素毒性。;（2）真核表达系统 ①酵母表达 毕赤酵母（pichia psatoris）受甲醇诱导。 优点：易培养无毒