ITRAQ技术常见问题与答疑.docxVIP

iTRAQ技术需注意的问题与答疑1．Itraq的原理是什么？Itraq的检测可以做这样的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的铺在了一个有384个孔的平板上，然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对，所以，如果假设每个一个样本中有100个蛋白，他们的浓度均为1%，那么得到的结果就是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，可以达到90以上；如果一个样本中有100个蛋白，有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。2．iTRAQ的主要优势是什么？(1)高通量。一次性定性和定量该样本的总蛋白，不用像双向电泳（2DE）或DIGE要逐个斑点做鉴定；2DE可分离1500-2500个斑点(并且可能很多斑点对应同一种蛋白)，而iTRAQ一般可鉴定2000种以上蛋白，其中常规动物组织或细胞可鉴定到4000-7000种蛋白；(2)结果直观、分析灵活——直接得到蛋白的定性和相对定量信息，可利用统计学方法快速筛选出各个组别的差异蛋白；能更好的结合基因组或转录组的数据，十分有利于后续研究。(3)对样本类型无限制——任何类型的样本均可做，当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多；对于罕见物种，可提供转录组数据来检索，更容易找到有意义的蛋白。(4)一次上机的样本数高达8个，如果样本数多于8个，还可以在每次上机时设置内参，每个样本先跟内参比较，再相互比较（排除操作、环境和仪器误差），从而实现多组样本间的差异蛋白分析。3．iTRAQ与其他蛋白质组学技术有何不同，我们该如何选择？双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术，适用于大部分样本，只是对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好；另外由于各个样本需要单独跑胶，很难避免操作误差对结果的影响，可能导致定量不准确；但是双向电泳的服务价格相对便宜，可以用于样本差异的初步筛选；DIGE在双向电泳基础上做了改进，引入了荧光标记物和内标，可以使定量更加准确；但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离，因此对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致，只是使用了不同的标记物；TMT有10种标记物，可对多达10种不同样本进行分析，但是由于其标记物的质量数非常相近，因此必须使用超高分辨率的质谱（Thermo公司的QE质谱仪）才可以满足检测，这也必然会导致信号干扰更多，可能会影响定量的准确性；label-free是非标记的蛋白质组学技术，由于没有标记物，其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性，该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术，并且定量的准确性较差，优势是服务费用较低；SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法，利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞，达到体内标记的目的，其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高；但是由于缺乏合适的同位素培养基，该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。从定量准确性、应用性等各方面综合考虑， iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。4．iTRAQ实验对样本有何要求?任何类型的样本都可以，如果是罕见物种，可以用近缘物种的数据库检索，也可提供转录组数据库来检索；一次上机，每组样本需要用200ug蛋白，但由于需要蛋白定量检测和预实验，因此每组样本所需的蛋白量大概在500ug左右；我公司负责蛋白质的提取，客户只需要提供足够的原始样本。5．不同类型的样本做iTRAQ可否一次上机？不能。如果样品来源于不同物种，检索时就无法选择数据库，也就无法分析数据；即使是同一物种的样本，它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别（比如植物的根和叶），将这些酶切肽段混合上机，其数据会相互干扰，导致蛋白定性和定量的不准确。6．iTRAQ实验是否需要设置重复？我们常说的重复包括生物学重复和技术重复，iTRAQ中常说到的还有上机重复；生物学重复即样本重复，采集来源于同一组别的不同样本（例如同样处理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等），通常设置3个生物学重复，但临床样本一般要求生物学重复更多（如疾病组和健康组各十几例样本）；当生物学重复的样本很多时，可以将同组样本混合后再标记，便可以通过一次上机检测；技术重复，通常是同一个样本用不同标记物标记，这样可以排除因蛋白提取、酶解、标记等操作引入的误差；另外ITRAQ实验有时会设计上机重复，这其实也属于技术重复的范畴，即相同的样本上两次机，来排除操作误差和仪器误差。目前发SCI论文一般需要设置重复（无论何种重复