89._核酸转膜探针标记讲解材料.ppt

实验 八、九 核酸转膜、探针标记、 分子杂交 实验目的 学习核酸杂交技术的相关知识及其重要性，掌握点杂交的转膜方法、探针的标记以及分子杂交操作过程。 相关知识 核酸杂交技术基本上是从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。 60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。 70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。 目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。 核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链之间进行。 由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步骤之一。 转膜 探针的标记 探针的标记方法：缺口平移、DNA快速末端标记、用T4多核苷酸激酶标记DNA 5’末端、随机引物延伸、聚合酶链反应。 核酸探针的种类：DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核酸探针。 在选择标记方法时，应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。 杂交的方法： 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 、点杂交（Dot blot）、Southern印迹杂交（ Southern blot ）、Northern印迹杂交（Northern blot）、组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等。 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 点杂交法是将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio–Rad )和Hybri–Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 点杂交法（Dot blot） Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的D