基因工程原理知识讲稿教程文件.ppt

基因工程基本原理;一、基因工程;基因工程主要发展史;1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验; 1972年, 美国斯坦福大学的Paul Berg研究组将SV40的一段DNA用EcoR1切下, 连接到噬菌体载体上, 转入细菌体内. 他们工作的创新性就在于能将已经存在的零星的方法综合起来, 建立了一项新技术. (1) 第一次证明了基因重组技术的可行性. (2) 第一次跨越种属界限的DNA重组 (3)第一次证明重组DNA分子能整合到宿主染色体中,并被扩增. 1980年获诺贝尔化学奖.; 70年代后期, 推动基因工程技术迅速发展的几大技术 ; 1.多种类的限制性内切酶的纯化鉴定及商品化. 2. DNA琼脂糖电泳技术的建立. 3. 核酸分子杂交技术 4. 大量克隆和表达载体的构建和商品化. 5. DNA序列的分析 6. 外源基因导入哺乳动物细胞并在其中表达. 7. 体外DNA序列扩增技术 ( PCR );具有抗病虫害的烟草;细胞核移植法 --- 动物整体克隆技术 鱼类和两栖的核移植早有成功 (童第周).;;基因工程主要发展史;主要步骤： 1、构建DNA重组分子 2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 3、基因的表达 ;目的 DNA片段 ;构建DNA重组分子;工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(RE);作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。;几种限制性内切酶的作用位点;目的基因;人工合成法;逆转录法;逆转录法;逆转录法;组织或细胞染色体DNA;The Nobel Prize in Chemistry 1993;PCR基本原理 ;;PCR仪设定的反应条件： 94oC 45 S DNA变性 55 oC 45 S DNA复性 72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min ;介绍：PCR仪;仪内发生的反应;;;;; PCR引物设计原则;;通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点; 引物设计软件介绍： Primer Premier 5.0 Oligo 6.57 Primer DSigner 1.1 Array Designer 2.00 ;PCR的应用;基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);;;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;DNA分子体外重组（外源基因与载体的连接）;Bam HⅠ切割反应;;安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;1. 重组体导入大肠杆菌 （1）氯化钙法 （2）电击法 （3）体外包装法 2. 重组体导入哺乳动物细胞 （1）磷酸钙共沉淀法 （2）脂质体介导法 （3）病毒感染法 （4）显微注射法 ;（1）原理;不需要载体。;脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）;直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。; 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。;1.根据重组载体的表型进行筛选 2.DNA限制酶切图谱分析 3. PCR鉴定 4. 利用核