第14章讲 基因重组与基因工程.ppt

　基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering　;本章内容;自然界DNA重组与基因转移DNA Recombination;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;Holliday模型中，同源重组的4个关键步骤 ;片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。; 内切酶 (recBCD);Date;二、细菌的基因转移与重组;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;Date;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;　;转导过程;三、特异位点重组 特异位点重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。;（一）λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合； 反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 ;（一）λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合。 （二）细菌的特异位点重组☆ （三）免疫球蛋白基因的重排 ; ;（三）免疫球蛋白基因的重排;免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。 ;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 ;V片段;Date;Date;四、转座重组;插入序列(insertion sequences, IS)组成： 二个反向重复序列(inverted repeats, IR) 侧翼的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 ;插入序列的保守性转座;Date;5‘;转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因;Date;由转座子介导的转座;重组DNA技术 DNA Recombination Technique ;一、相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 二、基本原理及操作步骤 ;重组DNA技术的发展史;一、重组DNA技术相关概念 ;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点： —— 回文结构(palindrome);;;;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间;②DNA的甲基化程度 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5