第二十章 重组DNA技术讲解(教学).ppt

科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 2.多核苷酸激酶： 　　在重组DNA技术中，多核苷酸激酶可用于标记DNA的5′末端，也可使缺失5′-P末端的DNA发生磷酸化作用。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 3.碱性磷酸酶： 　　能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5′磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或DNA片段的5′-P，以防止发生自身连接。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 第三节 重组DNA技术中常用载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 　质粒DNA 　噬菌体DNA 　病毒DNA 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 作为基因工程载体所需具备的基本条件 能自主复制 有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），利于外源DNA分子插入 具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 分子量小，以容纳较大的外源DNA 拷贝数高 具有较高的遗传稳定性 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 一、质粒载体 质粒 (plasmid) 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 （一）pBR322质粒载体（克隆6kb） 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 （二） pUC19 质粒载体 LacZ′基因与β-半乳糖苷酶 X-gal，5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 MCS区段：来自M13噬菌体 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 二、噬菌体（bacteriophage）载体 （一）?噬菌体 (phage)载体 （二）粘粒 (cosmid)载体 （三）M13噬菌体载体 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 ?噬菌体插入较大外源DNA片段（23kb） 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 与质粒载体相比，其突出优点是可插入较大外源DNA片段 噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 三、病毒载体 　　质粒载体、噬菌体载体都是以原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来为适应真核细胞重组DNA技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类 逆转录病毒载体 （整合型） 腺病毒载体 （游离型） 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 病毒载体的改造 带目标基因假病毒 包装细胞 目标基因 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 三、人工染色体载体 　　酵母人工染色体载体（YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段外源DNA。YAC可接受100kb～2 000kb的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 人工染色体载体包含的调控元件 ①着丝粒：以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞。 ②端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短。 ③复制起始点和限制性酶切位点。 ④YAC载体的两臂均带有选择标记。 ⑤原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 第四节 重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 一、目的基因的获得 （一） 化学合成法 （二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) （三）从基因文库中筛选 科学出版社案例式教材《生物化学》课件 （一） 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 科学出版社案例式教材《生物化学》课件《生物化学》课件 （二）聚合酶链反应