洗脱条件的选择.PPTVIP

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力 亲和层析原理 有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子，抗体与抗原，核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白，激素与其受体、载体蛋白，细胞与其表面特异蛋白等等，它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。 亲和层析介质的制备 配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节，配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联率，偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变，有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活性和理化性质。 亲和层析技术 吸附条件的选择 ：纯化生物大分子一般采用柱层析吸附法，根据亲和吸附剂的吸附容量和待分离物质的总量选择大小合适的层析柱。选择吸附条件时要考虑平衡缓冲液的组成、pH范围和离子强度，样品上柱的体积、温度和流速等因素，使亲和介质与被分离物质具有较强的亲和力。样品溶液的pH和离子强度要与平衡缓冲液一致，一般接近中性。假如样品中杂质多，纯化对象与配基结合力弱时，可以控制样品上柱的流速或重复过柱，以使纯化对象与配基间充分起作用。样品上柱后，用平衡缓冲液除去未吸附的杂蛋白，也可以用较高离子强度的盐溶液进一步洗去非专一吸附的杂质，尽可能在亲和柱上只留下专一吸附的结合物。 亲和层析法分离GST的试剂 缓冲液A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl 缓冲液B：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT 注：根据酶的性质在分离纯化过程中需要加入适量的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。 亲和层析法分离GST操作步骤 1. 亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备： Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂。 2. 亲和层析柱的准备： 装柱，柱床体积约4—6mL（柱高约2—3cm），连接蛋白监测系统，用Buffer A平衡（约10—20mL），至记录仪基线平稳。 * * 谷胱甘肽转硫酶简介 谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。 兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS－反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。另外，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。 亲和层析的优点：专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质；具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品；利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。 亲和层析法分离生物大分子示意图 配基 待分离的 生物分子 a. 载体 手臂