[农学]基因工程-第五章-克隆重组体的构建、转化.pptVIP

DNA测序技术的发展 非放射性标记检测物的使用 DNA测序自动化 计算机在DNA测序中的应用 现有技术的改进 基因芯片 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分目的重组子与非目的重组子 用EcoRI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb 用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb * 苏州科技学院生物系 叶亚新 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E 4.0 kb 2.0 kb 2.0 kb 区分目的重组子与非目的重组子 对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子 2.7 kb 2.0 kb E * 苏州科技学院生物系 叶亚新 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 部分酶解图谱法： 2.2 kb PstI EcoRI BamHI B B E 4.4 kb 1.2 1.8 kb E B 0.6 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据： BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb 其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端 BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb 其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表 明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8 kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后， 4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者 是连在一起的 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 三、核酸分子杂交检测法 具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则，高度特异性地复性形成双链。 杂交的双方是：待测的核酸序列+已知序列的核酸探针。 包括种类：菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern 印迹杂交和Northern 印迹杂交。 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 放射自显影 在标记了放射性同位素的细胞、组织、切片或其它生物样品上，压上一张X光胶片，放射性同位素的电离辐射作用于x光胶片上的乳胶，就像可见光一样产生了一个潜在的图象。因此，经过曝光，射线与乳胶作用产生电子，电子使卤化银还原成金属银，这样，便得到了放射性同位素的分布图。 在细胞水平上，放射自显影可用来确定生物大分子的合成部位，以及随后在细胞内的运动情况。 如：通过掺人‘H标记的脱氧胸腺嘧啶核甘酸，我们得知细胞核是DNA合成的主要部位。 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 第五章 克隆重组体的构建、转化 三、核酸分子杂交检测法 1、菌落原位杂交法 直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上通过溶菌和变性处理，使DNA暴露出来并与滤膜原位结合 再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 菌落原位杂交法的基本操作： 影印 用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 洗涤 杂交 感光 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 第五章 克隆重组体的构建、转化 三、核酸分子杂交检测法 2、Southern blotting 根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，以检测这些被转移的DNA片段。 是针对DNA分子进行的印迹杂交技术。 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 3、Northern blotting 是指将RNA分子变性及电泳分离