基因工程4-2简要基因工程的载体.ppt

4.2 ?噬菌体载体 4.2.1 噬菌体（phage）的一般生物学特征 phage是寄生在细菌体内的一类病毒，有蛋白质外壳，内含DNA。 * 烈性噬菌体：只具有溶菌生长周期的噬菌体。（噬菌体侵入寄主细胞后，进行DNA复制及蛋白质合成，使寄主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒） * 温和噬菌体：既能进入溶菌生长周期，又能进入溶源生长周期的噬菌体。（在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分） * 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌。（即含有原噬菌体的寄主细胞） * 原噬菌体 (prophage)：在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA（所谓整合是指噬菌体DNA已插入到寄主细胞染色体DNA之中）。 溶源性细菌具有免疫性，能够不再受同种噬菌体的侵染，这一现象称为超感染免疫性。 经过许多世代之后，溶源性细菌也能转入溶菌生长周期，此时噬菌体DNA从宿主染色体DNA上删除下来，这一过程叫做溶源性细菌的诱发。用小剂量的紫外线照射可以使溶源菌转入裂解状态。 4.2.2 ?噬菌体的基因及功能 ? DNA为线性双链分子，长度为48.6 kb，是一种中等大小的温和型噬菌体。 在分子两端，各有一条由12个碱基组成的彼此完全互补的5’延伸的粘性末端。 当? DNA被注入寄主细胞后，会迅速通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。这种由粘性末端结合形成的双链区段，称为cos位点（cohesive-end site，粘性末端位点）。 ? DNA至少包括61个基因，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，称为?噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，称为非必要基因。 取代了非必要基因的外源基因，可以随寄主细胞一道复制和增殖。 A—F：头部合成基因 Z— J：尾部合成基因 b2 区 ：功能不明 int、xis、red：重组基因(整合、割离和重组功能)。 int基因控制整合酶的合成，此酶能使? DNA整合到细菌染色体中。 xis基因编码删除酶，此酶能将原噬菌体从染色体上割离下来。 red 是促进重组的基因。 N、Q：正调控因子。N蛋白具有抗寄主终止因子的功能，促进o、p、red、xis、int基因的转录，属早期正调控因子。Q蛋白是晚期正调控因子，促进头、尾基因和溶菌基因的转录。 cIII、cI、cro、cII：负调控因子。 cI基因编码一种阻遏蛋白，该蛋白可使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性，促进phage进入溶源途径。cI基因停止表达，则噬菌体的溶菌生长周期开始。 cII 和cIII基因维持免疫性，阻止裂解基因S、R的转录，促进cI 基因转录。cro基因阻遏cI转录，同时也阻遏其余早期基因的转录 。 O、P ： ? DNA复制基因 S、R ：裂解基因，控制发生溶菌作用的两个基因。 ? DNA的复制在早期是按?形式从双向进行的，由一个环状分子复制成两个环状分子。若进入裂解途径的晚期，则进行滚环复制，由一个环状DNA分子复制成多个? DNA分子连在一起的线状长多连体分子。 在噬菌体包装时，? DNA的多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点处将它分离成单位长度的单体分子之后，才能够被包装起来。 4.2.3 ? 噬菌体的构建 1. 基本原理： ? DNA中的J基因到N基因区段为非必需区，该区段约占总DNA的三分之一，它的缺失或取代不影响?噬菌体的生长和裂解释放。故操作时先把J~N这一段非必需区去掉，而用事先设计好的片段取代之，设计好的这一片段具有限制酶的切割位点，且常常带有标记（如放射性同位素标记、抗生素抗性标记等）。 2. ? 噬菌体载体的类型 (1) 插入型载体 只有一个限制酶作用位点，插入外来的DNA片段能使该位点上的基因断开而失活。插入型载体承受的外源DNA片段较小，一般在10 kb以内。 * 免疫功能失活的插入型载体： 在其基因组中有一段免疫区(imm434)，该区段带有一两种限制酶的单一切点，并都位于cI基因内部。若外源DNA片段插入到这种位点上，会导致cI基因失活，从而使该载体进入溶菌周期，产生出清晰的噬菌斑；而没有外源DNA插入的亲本噬菌体可以变成溶源状态，形成浑浊的噬菌斑。  * ?-半乳糖苷酶失活的插入型载体： 在其基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其上有lac