研究生生物技术综合指导.doc

发酵工程部分 实验一 综合大实验——100 L发酵罐小试耐高温а-细菌淀粉酶 细菌淀粉酶100L全自动发酵罐小试 一、目的要求; 掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构; ⑴ 发酵罐主体(100L不锈钢罐)； ⑵搅拌动力系统 ⑶ 无菌通气系统；⑷蒸汽灭菌系统；正确把握各阀门的操作 ⑸ 加热冷却循环系统；各管道联络关系；⑹ 智能控制系统 2. 掌握发酵罐小试的基本操作，包括;培养基配制，灭菌，接种，参数设定。 3. 掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡， CO2。 4. 运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律 二、淀粉酶水解原理及制备工艺 1. 根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2.）。 （1）α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。 （2）β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1，4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。 2．根据作用的温度分为耐高温淀粉酶（一般耐受温度80 ℃-100 ℃），中温（30 ℃-50 ℃）淀粉酶以及低温（耐受温度20 ℃以下） 3．根据作用的酸碱环境分为耐酸性淀粉酶（一般耐受pH5.0以下），耐碱性淀粉酶（耐受pH8.0以上）。 4. 本综合实验就是运用微生物发酵淀粉酶速度快活力高的特点，制备细菌淀粉酶，为《酶工程》、《分离工程》等专业课提供酶源。通过掌握淀粉酶发酵工艺，为将来进入发酵工厂生产相关产品打下坚实基础。 三、实习操作步骤: 1. 介绍机械搅拌通风发酵罐的基本结构(一个上午) 2. 培养基的配制: 配方:3％麸皮，消泡剂0.3%(植物油)，配制70 L; pH电极的标定：pH4.00，pH6.86两点标定 装料、灭菌(121 ℃，30 min) 注意各阀门的开启，红绿，黑色代表的含义，灭菌时关闭所有绿色阀门，打开红色阀门，使蒸汽从夹套、空气进口管加热发酵罐，并使少量蒸汽流经取样口，对取样口进行灭菌，开动搅拌电机至100 r/min，充分灭菌。灭菌完毕，关掉所有蒸汽阀(红色)、加热器底部排水阀、放料口处取样阀。 溶氧电极“0”值的标定 灭菌完毕，此时发酵罐中为100％水蒸气分压，标定溶氧为“0”。或者饱和亚硫酸盐标定为“0”。 降温冷却 开启冷却循环水，使冷却水从夹套对发酵罐进行降温;同时开启鼓风机，使少量空气进入发酵罐，维持正压。 取样操作: 旋松放料口螺旋阀门(开启方向与正常螺旋相反)，打开取样阀，先弃掉约20-30 mL样液，再收集50-100 mL灭菌培养基液体，关闭放料阀、取样阀。样液用4层纱布过滤样液，样液作测定残糖含量、生物量、淀粉酶活力，蛋白质含量测定。 接种 当罐温降低至40 ℃以下，采用火圈法接种摇瓶种子100 mL，接种量为1.0％。 溶氧电极“100”值的标定 搅拌速度开至最大，通气量开至最大，标定溶氧为“100”。 设定发酵参数，运行发酵指令 温度30-35 ℃；通气量6-8 L/min(手动设置)，维持正压0.02-0.03MPa；搅拌速度200-300 r/min；自然pH值 四、根据发酵周期、每班分成6-8组，每组4人。发酵过程参数的检测 根据每12小时取样测定一次(早上8:00-12:00，晚上7:00-10:00)，从取样口取样50-100 mL发酵醪液，4层纱布过滤，取滤液为待侧液。 1. pH值，直接读数梅特勒pH电极显示值 2. 温度，直接读数温度电极显示值 3. 通气