生化分析精品教学（华南理工大学）生化分析02.pptVIP

第2章 电泳法（1） 电泳现象： 在盛有红褐色Fe(OH)3胶体U形管的两个管口，各插入一个电极。接通两个电极间的直流电源，会观察到阴极附近红褐色逐渐变深，阳极附近红褐色逐渐变浅的现象，表明带正电荷胶体粒子在电场作用下向阴极移动，这就是电泳现象。 第2章 电泳法（2） 电泳法：利用在相同电场力下，待分离样品中各种分子的带电性质以及分子自身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、检测或提纯的技术。 电泳法创建人：蒂塞利乌斯 瑞典化学家，斯韦德贝里的学生（参与超速离心机的设计、制造） 1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究；1930年改进实验手段和装置，发表了关于色谱法和吸附的论文；1935年改建原有电泳装置，发展了区带电泳法，大大提高了效率和分辨率；1940用自己设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分，分别命名为：白蛋白?、?、?和球蛋白。从此，电泳法开始广泛应用于分离、鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。 基于上述成就，获得1948年诺贝尔化学奖。 电泳法（3） 电泳法分类： 根据被分离样品的多少：分析电泳和制备电泳 根据电泳电压的高低：常压电泳100~500 V（1~10 V/cm） 高压电泳500~10 KV（20~200 V/cm） 根据电泳中是否使用载体： 显微电泳：直接用显微镜观察细胞等大颗粒物质电泳行为 自由电泳：不使用载体，在溶液中进行（分辨率差，装置复杂昂贵） 区带电泳：使用载体（载体可抑制界面间的扩散和对流，有些载体还有筛分作用，因此可提高分离效率和灵敏度；装置简单方便） 区带电泳（1） 根据载体的物理性质分类： a. 滤纸及其他纤维素薄膜如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维；b. 凝胶如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、硅胶、淀粉胶；c.粉末如纤维素粉、淀粉、玻璃粉；d. 丝状如尼龙丝、人造丝 根据载体装置形式不同：平板式、垂直板式、垂直柱式 根据电泳系统pH是否连续： 连续pH电泳；不连续pH电泳（不同pH区之间形成高的电位梯度，使待测组分移动加速而被压缩为极狭窄的区带，浓缩且可提高分辨率） 区带电泳（2） 区带电泳的共同特点 固定相：支持载体如凝胶、滤纸等（惰性：与组分无作用） 流动相：电极缓冲液 分离效果：形成区带 区带电泳操作流程 a. 制备固定相；b. 配制电极缓冲液；c. 上样； d. 接通电源进行电泳； e. 染色（蛋白与核酸大多无明显信号）；f. 分析 2-1 基本原理（1） 影响带电粒子迁移速率的因素 当带电离子以速度v 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力（FE）和平动摩擦阻力（F）的作用 2-1 基本原理（2） 影响电泳分离的因素： 物质自身的结构和性质：荷质比差异越大分离效果越好（电泳迁移率的主要影响因素）；粒子形状也有影响。 外部因素 支持介质：天然琼脂糖和聚丙烯酰胺等（选择依据：吸附和电渗要小） 溶液介质：缓冲溶液。关键指标：pH（影响解离程度和荷点性质）和离子强度I（通常控制在0.02~0.2 mol/L。过高：电泳速率慢，热量高；过低：pH易变化，扩散增大，分辨率和重现性变差） 电场强度：E大可使分析速率加快，抑制扩散，提高分辨率；但E过高时会产生大量焦耳热，必须冷却（500 V以内为常压电泳，不需冷却） 温度：影响重现性 2-2 常规电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 等点聚焦电泳 双向电泳 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（1） 以醋酸纤维素薄膜为支持介质的电泳。醋酸纤维素薄膜是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（CAM）。 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（2） 实验操作步骤（1）： 预处理：a. 膜的准备（合适大小；距边缘2 cm划上加样线）；b. 膜片浸泡（置于缓冲液中浸泡完全，用滤纸片吸去多余缓冲液） 加样：用毛细管、微量注射器等在加样线处平稳的前后或左右来回移动加样，样品线条不应超过4 mm；加样体积大小与样品浓度及检测方法关系密切。 电泳：将膜片安放在电泳槽支架上，在电泳槽的电极室内注入适量缓冲液，再用3~4层滤纸做盐桥连接膜片和缓冲液，然后盖上电泳槽，待膜片水平静止10 min后接通电源进行电泳。（需要控制适当时间） 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（3） 实验操作步骤（2）： 染色：染色剂不应溶解醋酸纤维素薄膜，可根据样品选择合适染色剂如蛋白质可选择氨基黑10B、丽春红S等。 漂洗/脱色：将薄膜取出移至漂移液中，漂洗若干次至无样品区无色 干燥