黄芩苷黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究.docxVIP

黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究【摘要】目的:研究黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗药性的逆转作用,并初步探索其逆转机制。方法:以平皿法测定黄芩苷/黄芩素与苯唑西林对MRSA的协同抗菌效力;以分光光度法测定黄芩苷/黄芩素协同苯唑西林对MRSA生长密度的抑制作用;以青霉素结合蛋白(PBP2a)胶乳凝集试剂盒检测黄芩苷/黄芩素对PBP2a生成的抑制效力。结果:黄芩苷/黄芩素联合苯唑西林对临床分离的MRSA有显著的协同抗菌作用,16μg·mL-1的黄芩素即可显著逆转MRSA对苯唑西林的高度耐药;黄芩苷/黄芩素对MRSA产生PBP2a有显著抑制作用。结论:黄芩苷/黄芩素可通过抑制MRSA产生PBP2a来逆转其对苯唑西林的高度耐药,这一现象从理论上为临床治疗MRSA感染提供了新的方法和思路。【关键词】黄芩苷?黄芩素?苯唑西林?耐甲氧西林金黄色葡萄球菌?逆转作用?青霉素结合蛋白?黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorsi的干燥根,性寒,味苦,具有清热燥湿、泻火解毒等功效。在临床上被广泛应用于上呼吸道感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎和高血压等症的治疗。目前的研究认为,黄芩的抗菌有效成分是黄酮类化合物,包括黄芩苷(Baicalin)、黄芩素(Baicalein)、汉黄芩素(Wogomin)、汉黄芩苷(Wogonoside)、黄芩新素Ⅰ(Skullca_pflavoneⅠ)、黄芩新素Ⅱ(SkullcapflavoneⅡ)等。迄今,黄芩的广谱抗菌活性已得到广泛认同。体外实验证明,其对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和螺旋体等均有抑制作用,这也是其临床用于细菌感染性疾病的理论基础[1～4]。有研究表明,黄芩苷与青霉素合用,可使对新霉素和青霉素的金黄色葡萄球菌抗性株最低抑菌浓度降低15～30倍,并呈量效关系。对此类耐药菌感染,加用黄芩苷可恢复其抗菌活性,对临床联合用药逆转细菌耐药提供了初步理论依据[5]。本试验的目的在于进一步确证黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗药性的逆转作用,并初步探讨其可能的逆转机制。1材料1.1仪器多点接种仪(日本仓光株式会社);BS124S型电子分析天平(德国Sartorius公司);恒温空气摇床(上海跃进医疗器械厂);LRH-250A型生化培养箱(广东省医疗器械厂);DU-650型分光光度仪(美国Beckman公司)。1.2试药苯唑西林(重庆药友制药有限公司,批号:050904);黄芩苷、黄芩素对照品(中国药品生物制品检定所,批号分别为375756、465119);M-H培养基(杭州天和微生物试剂有限公司,批号;酵母提取物、胰蛋白胨(上海生物工程有限公司,批号分别为0701B02、218-181214PBAC-T);青霉素结合蛋白(PBPS2a)胶乳凝集试剂盒(英国Oxoid公司,批号:13506)。1.3菌株26株MRSA分离自第三军医大学西南医院2005年临床标本,经BD BBL Crystal细菌自动鉴定仪重新鉴定确认;质控金黄色葡萄球菌[ATCC25923]购自中国药品生物制品检定所。2方法2.1最低抑菌浓度(MIC)的测定采用平皿法,分别将含有倍比稀释浓度的苯唑西林、黄芩苷、黄芩素混入14mL M-H琼脂培养基,冷却。取预先过夜培养的待测MRSA菌株,挑取菌落适量,比浊为0.5MacFar-land(即1×107～8个.mL-1),用多点接种仪接种于平皿,待菌液干后放入培养箱培养24h。2.2细菌生长密度(OD值)的测定采用试管法,在含有倍比稀释浓度的苯唑西林M-H培养液中分别加入适量黄芩苷或黄芩素,使其浓度分别为128、64、32、16μg.mL-1和64、32、16、8μg.mL-1。取预先过夜培养的待测MRSA菌株X265,挑取菌落适量,比浊为0.5Mac-Farland(即1×107～8个.mL-1),分别加入上述各培养管,使细菌终浓度为106个.mL-1,混匀,置于空气摇床中,于37℃震荡培养24h,用分光光度仪在600nm波长处测定OD值。2.3PBPS2a胶乳凝集试验按照试剂盒操作说明进行。分别设空白组、黄芩苷(256、128、64μg.mL-1)组和黄芩素(32、16、8μg.mL-1)组,于L-B肉汤中震荡培养过夜,观测在以上浓度干预下MRSA(X265、X266、X271、X274、X275、X295、X300、X302、X303、X304)的胶乳凝集过程,观察其凝集结果。3结果3.1联合药敏结果在黄芩苷的干预下,26株MRSA对苯唑西林的MIC整体上均显著下降了2～4个倍比稀释度,其中X274、X275、X296和X304下降了5个倍比稀释度,由1024μg.mL-1降至3