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试管动物 1978年7月25日深夜时分，英国曼彻斯特郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭声划破夜空，震撼了世界……她就是世界上第一例试管婴儿——路易斯.布朗。 试管动物概念：将供体的卵子与精子在体外受精，体外培养受精卵（胚胎），然后将发育到一定程度的胚胎移植到受体，得到各种动物。由于体外受精一般都是在试管内进行，所以称为试管动物，也成为“体外受精动物”。 试管动物的培育流程 一. 卵子的采集与成熟培养 二. 精子的采集与体外获能处理 三. 卵子和精子的体外受精 四. 受精卵的体外培养 五. 胚胎移植 一. 卵子的采集与成熟培养 1）卵母细胞采集 卵母细胞的采集方法通常有三种。 ⑴超数排卵：对于实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等采用的主要方法是；用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。 ⑵从活体卵巢中采集卵母细胞 ：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。 在家畜中， 牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中，活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已用于商业化生产。 ⑶从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃）后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期（GV期），需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。 2．母细胞的选择：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。 3．卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。 影响卵母细胞体外成熟的因素 (1)动物种类 (2)卵母细胞供体母畜年龄及性机能和卵巢状态 (3)卵母细胞类型 (4)卵巢运输、取卵方式和季节 (5)培养系统 卵母细胞成熟的特征 卵母细胞成熟是指充分生长卵母细胞向成熟卵母细胞转化的过程。 卵母细胞体外成熟主要包括减数分裂的恢复和完成，以及细胞质、细胞膜、透明带、卵丘细胞的成熟变化。 第一极体排出标志着卵母细胞已达到核成熟。 排卵后，卵母细胞核的发育似乎出现短暂停滞状态，并因受精而激活，也可因某些物理、化学、生物因素而激活，完成第二次减数分裂，放出第二极体，成为成熟卵子。 二. 精子的采集与体外获能处理 1）.精子的采集 方法有：假阴道法,手握法,电刺激法, 2)．精子的获能：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获