21三体综合征诱导多能干细胞系的建立及诱导神经分化的分析 word格式.docxVIP

胞系，并通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、qPCR 检测基因表达等方法鉴定其多能性。2.利用 EB 悬浮培养法对细胞进行体外分化，用 PCR 检测各胚层特有基因的 表达情况，并各取 1×107 个 T21-iPSCs 注射到 SCID 小鼠皮下，6 周后得到畸胎 瘤，行 HE 染色，观察 iPSCs 在体内的分化情况。3.T21-iPSCs 每传 10 代重复一次核型分析，检测 T21-iPSCs 遗传性状的稳定 情况。4.1×105 个感染后的两种来源细胞接种在饲养层上，比较出现克隆的时间长 短；在 25 天进行碱性磷酸酶染色，得到出现阳性克隆的效率并进行统计学分析。5.对 T21-iPSCs 及正常人 iPSCs 利用 EB 诱导法进行体外神经干细胞的诱导 分化，进行免疫荧光染色并比较阳性率；获得神经干细胞后添加特定细胞因子进 一步诱导其向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化，进行免疫荧光染色并 通过特异蛋白阳性表达来比较分化效率。【结果】1.分别建立了羊水细胞及皮肤成纤维细胞来源的 21 三体综合征的诱导多能 干细胞系，通过免疫荧光染色发现胚胎干细胞特异性表面抗原 Oct4、Nanog、 TRA-1-60、SSEA-4 染色阳性；qPCR 检测的 T21-iPSCs 内源性多能性基因 Nanog、 Oct4 已被激活，与正常人 ES 细胞表达水平相似；在持续传代过程中细胞形态学 表现稳定，核型检测发现 T21-iPSCs 在传代过程中能维持异常核型；畸胎瘤实验 发现 T21-iPSCs 形成的畸胎瘤可分化为三个胚层。2.约 1×105 个感染后的两种类型细胞接种在饲养层上，羊水细胞在 5-7 天时 出现了胚胎干细胞样的克隆，而皮肤成纤维细胞在 13-15 天出现克隆。在 25 天 进行碱性磷酸酶染色，羊水细胞来源的得到 285 个阳性克隆，效率为 0.285%。 皮肤成纤维细胞得到 27 个克隆，效率为 0.027%。经 X2 检验 P0.05，诱导羊水 细胞与皮肤成纤维细胞形成多能性干细胞的效率差异有统计学意义。3.对 T21-iPSCs 进行神经诱导分化，T21-iPSCs 与正常人 iPSCs 体外分化神 经干细胞免疫荧光结果显示 Nestin、Pax6 呈阳性，比较诱导效率无显著差异。 继续将神经干细胞诱导分化为三种神经细胞系，细胞免疫荧光检测结果显示三种2神经细胞系的表面标志 Tuj1、GFAP 和 O4 的表达为阳性。在分化成神经元和神经胶质细胞的效率方面，T21-iPSCs 与对照组相比无显著差异。【结论】1.21 三体综合征疾病的诱导多能干细胞系在体外长期传代中能维持异常核 型及干细胞多能性，可作为 DS 研究的细胞模型；2.利用羊水细胞建立 T21-iPSCs 效率高于皮肤成纤维细胞，羊水细胞可能是 制备 T21-iPSCs 的理想细胞类型；3.T21-iPSCs 在神经分化过程中，向神经干细胞、神经元及神经胶质细胞分 化的效率与正常的 iPSCs 相比无显著差异。【关键词】21 三体综合征；羊水细胞；皮肤成纤维细胞；诱导多能干细胞；神 经分化3Generation of Human Down Syndrome-Induced PluripotentStem Cells and Their Potential for Neural DifferentiationMajor：PediatricsMaster candidate：Du Rong Supervisor：Prof. Chen YaoyongBACKGROUND:Abstract21 Trisomy（T21） syndrome or Down’s syndrome（DS）,which is the leading genetic cause of intellectual disabilities and related diseases.In China, about 1/600 to 1/800 of live births carry a trisomy 21, which causes Down’s syndrome.The genes on chromosome 21 are most likely to be associated with Down’s syndrome, but the detailed mechanism are difficult due to high genetic complexity and phenotypic variability of Down’s syndrome. Despite progress in mouse models for Down’s syndrome, there rem