【教案】仪器分析 第三章 高效液相色谱分.doc

【教案】仪器分析 第三章 高效液相色谱分 内容提要：了解高效液相色谱法的优点及适用范围；理解各种分离方式的原理及选择原则；了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程； 理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；重点难点：高效液相色谱法的优点及适用范围；各种分离方式的原理及选择原则授课方式：讲授【板书】下述内容黑体部分 【讲解】 §3.1高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。二、特点1.高压: 可达150～350×105 Pa2.高速: 高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时.3.高效：高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g，荧光检测器10-11g5．高度自动化计算机的应用，使 HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。6．应用范围广（与气相色谱法相比） HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 ~ 80%。7．流动相可选择范围广 它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。8．馏分容易收集 更有利于制备。 §3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素一、与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；主要区别：流动相为液体。气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。 二、对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：1.涡流扩散项 ： He = 2λdp 含义同GC法2.纵向扩散项65/-1： Hd = CdDm/u；在LC中可略,GC中重要；3.传质阻力项：a.固定相传质阻力项；b.流动相传质阻力项.结论66/-1；改进固定相就成为提高液相色谱柱效一个重要问题. 综合分析，由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+Cu 3-6形式与GC一致，其主要区别在于扩展项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。67/1；-2.从3-6式看出，H近似正比于d2p ，所以67/2;9:减小粒度是提高柱效的最有效途径。4.其它影响因素68/2；柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展. a.柱前展宽：主要由进样所引起；b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小。 §3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱1.特点：a.流动相和固定相都是液体b.两相应互不相溶，有明显的分界面2.分离机制：溶质在两相间进行分配K = cs/cm = kVm/Vs分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响. 3.分类：a.正相液-液色谱法：流动相的极性小于固定液的极性；b.反相液-液色谱法：流动相的极性大于固定液的极性；c.化学键合固定相：将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。反相化学键合相色谱法已成为高效液相色谱法中应用最广泛的一个分支. 二.液-固色谱法（或液-固吸附