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在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制 ——调控网络的研究方法 蒋舜媛 董霞 程在全 2002-12-05 报告提纲 调控网络概述 调控网络的分类 调控网络的研究方法 在基因水平上探索基因表达的代谢和遗传控制 调控网络概述 在生物机体内，所有生命活动过程都受到严格的调节控制，以最有效地方式和途径适应内外环境的变化，以有利生物机体的生存繁衍，这些调节控制可以从不同的层次水平，通过不同的途径和方式，以不同的机制进行调控，而且，不同的调节途径和方式彼此之间可以发生有机的联系，相互作用、相互影响，协调一致，从而构成了复杂的调控网络。 调控网络的分类 可根据不同功能分类： 神经调控网络 免疫调控网络 代谢调控网络 激素调控网络 细胞内信号传导调控网络 基因表达水平的调控网络 调控网络的研究方法 组织及细胞学方法 基因突变技术 突变体筛选 基因工程技术 基因缺失 基因过表达 转基因技术 生物芯片技术 基因芯片 蛋白质芯片 在基因水平上探索基因表达的代谢和遗传控制 Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale Joseph L. DeRisi, Vishwanath R. Iyer, Patrick O. Brown Science Vol. 278. 24 Oct. 1997: 680~686 目前， 10多种微生物的基因组全序列已测定。在以后几年中，将有望知道几种多细胞生物的基因组全序列，其中包括人类基因组序列。然而，在这些基因组中，明确每一种基因的功能和作用将是一项十分艰巨的任务，而且从整体水平上了解基因组在生物机体复杂的生命历程中如何发生作用，对于我们将更是一个严峻的挑战。。 知道一个基因何时何地被表达常常为其生物学作用提供了强有力的线索。相反，在一个细胞中，不同基因的表达模式能够为细胞所处状态提供详细的信息。尽管蛋白质丰度的调节在一个细胞中绝不单独通过mRNA的调控来完成，但实际上细胞类型或状态的所有差异则与许多基因的mRNA水平的改变有关。这是偶然的，因为对特定基因测定其mRNA含量则需要一特效试剂，即是其cDNA序列。DNA微阵列技术（基因芯片），是将数千个单个基因序列高密度排列在一张显微镜载玻片上，这种技术为在大规模的研究基因表达提供了一种实用经济的工具。 酿酒酵母是一种进行基因表达的系统观察研究特别好的研究材料。这些基因在基因组序列中容易识别，顺式调控元件通常紧凑并靠近转录单元，有关它的遗传调控机制已经了解很多，并且一套有力的工具可用于它的分析。 酵母糖代谢的一般特点 酵母自然生长史中的一个重复循环包含了从厌氧（发酵作用）到需氧（呼吸作用）代谢的转换。 将酵母接种到富含糖的基质中会引发由发酵提供能量的快速生长，产生乙醇。 当可发酵的糖用尽时，酵母细胞转向将乙醇作为碳源供有氧生长。 这个基于葡萄糖损耗的从厌氧生长到需氧呼吸的转换，即指如双峰转换（Diauxic shift）. 该转换与涉及到细胞基本代谢过程中的基因表达中普遍改变有关，这些代谢包括碳代谢、蛋白质合成，和碳水化合物储存等。 Fig. 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression. 酵母中的代谢途径 糖酵解 有氧呼吸 TCA循环 乙醛酸循环 糖异生 我们使用DNA微阵列来刻画整个基因组的基因表达过程的变化，并研究调控和执行该过程的遗传途径 基因芯片技术研究糖代谢中基因表达调控的一般过程 图解说明 DNA微阵列制备： 利用购买的一组引物对, 将酵母的开放阅读框部分通过PCR放大.，包含大约6400个清楚的DNA序列，被用一个简单的自动机械印刷装置印刻在玻璃载片上, 构成相应的DNA微阵列。 mRNA探针制备： 将来自以指数生长培养的酵母细胞接种到新鲜的基质中在30°C生长21小时。在开始生长9小时后，然后依次获得经历间隔2小时7个不同阶段连续培养的样品，并分离制备mRNA 。 cDNA制备： 通过Cy3(绿色)或 Cy5(红色)-标记的dUTP经反转录制备荧光标记的cDNA， 杂交： cDNA与微阵列杂交。 观察、分析 图解说明 为使识别基因表达水平变化的可靠性最大化，我们标记了从每个连续间隔时间点培养的细胞中获得的cDNA, 用Cy5标记， 然后将其与Cy3-标记的对照cDNA样品混合 ，后者来自于从接种后的第一个间隔时间得到的细胞。 在这个实验设计中，测量每一个排列单元Cy3和Cy5荧光物质的相对荧光强度，可以提供为两个细胞群体中对应mRNA