DNA重组的机理---精华版.pptVIP

λ噬菌体的位点特异性整合 噬菌体的对E.coli的整合： POP’ + BOB’ →BOP’+POB’ B、鼠沙门氏菌鞭毛抗原的转换 H片段 C、免疫球蛋白基因重排过程 V片段 J片段 五、重组DNA技术简介 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。 重组DNA操作一般步骤： 分：分离目的基因 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出合适的受菌体 1、分：分离目的基因 目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型：cDNA(complementary DNA) 基因组DNA(genetic DNA) 获得需要的目的基因常用的方法： （1）总DNA：直接从生物体中提取，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）mRNA：以其为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）PCR：利用聚合酶链式反应，特异性地扩增所需要的目的基因片段； （4）化学合成 2、接：目的基因与载体连接 载体：运送目的基因片段进入宿主细胞的工具。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母人工染色体载体等 质粒载体的一般结构 3、转：重组DNA转入受体菌 导入合适的宿主菌，通过细菌的繁殖，获得重组质粒的克隆。 转化（genetic transformation）：直接将外源DNA导入宿主细胞。 转染（transfection）：利用病毒作为运载工具导入宿主细胞。 4、筛：筛选出合适的受菌体 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 步骤小结 目的基因获取 菌体培养，重组子的筛选 感受态细胞的DNA转化 宿主菌感受态细胞制备 重组质粒构建 载体质粒提取 * * * * 1、转座重组的特点 2、转座子与反转座子 3、转座机制 主要内容： 1、转座重组的特点： 与同源重组和位点特异性重组不同的是：转座子的靶点与转座子并不存在序列的同源性。接受转座子的靶位点可能是随机的，也可能具有一定的倾向性（如存在热点或一致序列），这与转座子本身的性质有关。 不必借助同源序列就可以移动DNA片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关； 原核生物和真核生物均可发生转座重组； 转座序列可在染色体上移动甚至可以在不同染色体间跳跃。 2、转座子 转座子(Transposon)又称跳跃因子,是指可以在生物的染色体组中从染色体的一个位点“跳”到另一个位点,或从一条染色体转移到另一条染色体上的一定长度的DNA片段 。 分为：原核生物转座子 真核生物转座子 原核生物转座子 简单转座子（插入序列） 复杂型转座子 复合型转座子 Ｍｕ噬菌体 插入序列（IS） 较小，长度一般在700bp～1800 bp之间； 绝大多数两端含有10bp～40 bp长的反向重复序列； 通常内部只有一个基因，编码的蛋白质是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），没有任何抗生素或其它毒性抗性基因； 通过“剪切”和“粘贴”的方式进行转座，转座结束后可导致插入点序列重复； 有少数IS，没有明显的反向重复序列，它们是通过复制（滚环复制）与粘贴的方式进行转座的。 复杂型转座子 长度较长； 两侧含有较长的反向重复序列； 内部含有一个或几个结构基因，常见的结构基因有：转座酶基因—tnpA，解离酶基因—tnpR和抗生素抗性基因； 转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在转座子两侧产生直接重复序列。 复合性转座子 由2个插入序列和一段带有抗生素抗性或其它毒性抗性的间插序列组合而成，其中的2个插入序列位于转座子的两侧，相互间的方向可能相反，也可能一致。每一个插入序列具有典型的第一类转座子的特征，带有转座酶，它可能独立地转位，也可能与间插序列一起作为一个整体进行集体转移。 Mu噬菌体 Mu噬菌体是大肠杆菌的一种温和性噬菌体，其DNA为线性双链，长度约为38 Kb，两侧无反向重复序列，基因组有20多个基因，但只有A基因（编码转座酶）和B基因（与复制和转座有关）与转座有关联。 在转座的过程中，可引起靶位点序列重复。在溶源状态下，它能在宿主DNA的不同位置间随机转移。 真核生物的转座子 Barbara McClintock Nobel