alteromonas sp.a321产浒苔多糖降解酶及酶学性质研究 word格式.docxVIP

Alteromonas sp.A321产浒苔多糖降解酶及酶学性质研究摘要浒苔多糖是一种由鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸组成并含有硫酸基的聚阴离子糖链。近年来，因其特殊的结构、较好的生物活性和广泛的生物来源，受到越来越多人的关注。浒苔多糖降解酶是指可以将浒苔多糖降解为小分子寡糖的一种酶，该酶的首次发现是对现有海藻工具酶种类的丰富和完善。本论文对浒苔多糖降解酶产生菌的筛选、鉴定、产酶条件优化、酶的分离纯化和酶学性质等做了系统的研究。1. 通过平板初筛和摇瓶复筛，从腐烂浒苔表面筛选出一株高产浒苔多糖降解酶的菌株，编号为A321。通过形态学观察、生理生化及16SrRNA序列分析进行菌种鉴定。结果表明该菌株属于交替单胞菌（Alteromonas sp.）。2. 通过单因素和响应面实验相结合的方法，确定了Alteromonas sp.A321发酵产酶的最适培养条件为：初始pH7.3，摇瓶装液量75ml/250 ml，接种量8%，培养温度28 oC；最佳培养基组成为：浒苔多糖0.93%、硝酸钠0.41%、氯化钠1.03%、MgSO4 0.10%，K2HPO40.40%。在最佳培养基组分和培养条件下发酵48 h，酶活为0.744 U/ml。发酵产酶曲线结果表明该菌株在36 h时产酶量最高，为0.753 U/ml。酶解实验证明该酶可以高效降解浒苔多糖，酶解7 h后还原糖得率达到63.53%。3. 对菌株Alteromonas sp.A321 产生的浒苔多糖降解酶进行硫酸铵沉淀、DEAE-CL-6B、DEAE-FF、Q-FF离子交换层析、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析，获得两种电泳纯的浒苔多糖降解酶，分别命名为酶L1和L2。酶L1和L2的纯化倍数分别为35.78、42.35，比活分别为19.32 U/mg、22.86 U/mg。电泳结果表明酶L1的分子量为76.4 kDa，酶L2的分子量为102.5 kDa。经测定，酶L1的N-端氨基酸序列为A-N-P-A-A-P-G-E，BLAST比对结果表明酶L1为一种新酶；未能测出酶L2的N-端氨基酸序列。I4. 对纯化的酶L1和L2的酶学性质分别进行研究，结果表明，酶L1和酶L2的最适反应温度分别为35 oC和30-35 oC，最适pH分别为7.0和6.0。Na+和K+对酶L1和酶L2的活性没有影响；Zn2+、Hg2+、Cu2+、Co2+、Al3+对酶L1和酶L2均有抑制作用。低浓度的SDS促进酶L1和L2的活性，而高浓度的SDS 抑制酶L1和L2的活性。邻菲罗啉促进酶L1的活性，抑制酶L2的活性。酶L1 和酶L2的Vmax分别为8.87 μmol/min/ml，2.99μmol/min/ml；Km分别为46.69 mg/ml，3.37mg/ml。酶解产物的质谱分析表明酶L1的降解产物为酸性寡糖片段；酶L2的降解产物为中性寡糖片段。该酶在研究浒苔多糖的构效关系和实现浒苔的高值化利用有广泛前景，并且该酶可用于制备低分子量浒苔寡糖。相对于目前采用的物理降解法和化学降解法，酶解法不需要复杂的实验设备，也不会对环境造成污染。因此，获得高活力产酶菌株并完成酶的性质研究具有重要的理论和现实意义。关键词：浒苔多糖、Alteromonas sp.A321、降解酶、筛选、分离纯化、酶学性质IIStudyof degradasesforpolysaccharides fromEnteromorphaproliferaproducedbyAlteromonassp.A321AbstractPolysaccharidesfromEnteromorphaprolifera(PE)arerecognizedasonekindof polyanionpolysaccharidesandcomposedofrhamnose,xylose,glucuronicacid,and somesulfate.Recently,PEarebecomingincreasinglypopularduetotheirunique structuralfeatures,bioactivity,andabundantsource. Degradaseforpolysaccharides fromE.prolifera(DPE)isonekindsofenzymetodegradePEformicromolecule oligosaccharides.The researchof DPE enrichesandperfects thetypes of seaweedtool enzymes.Thus,thisthesisstudiesthescreeningoftheDPEproducingstrains,the identificationoft