总RNA提纯.docVIP

总RNA提纯 5ml离心管中加入1ml Trizol，取约50-100mg组织加入离心管中，剪碎，匀浆，将匀浆液转移至1.5ml Ep管中，室温静置5min。 12000rpm 4℃ 10min，以清除不溶物，转移上清至1.5ml Ep管中。 加入0.2ml氯仿，混匀，静置2-3min。 12000rpm 4℃ 15min（降速为零），取上层水相于1.5ml Ep管中。 加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10-15min以沉淀，或-80℃ 30min沉淀。 12000rpm 4℃ 10min，离心后可见白色沉淀于管底，弃掉上清。 加入1ml 75%乙醇洗涤，12000rpm 4℃ 5min。重复一次。 弃掉乙醇，干燥（0.5~1小时）。 取1ul RNA样品，加入49ul DEPC水，混匀，稀释50倍，测浓度。 总RNA中DNA的消化（1） 材料 （1）DNase I：RNase Free；5U/μl，每U DNase最多可消化8μg总RNA。 （2）10×DNase I Buffer：含Tris-HCl（pH7.5）400mM，MgCl2 80mM，DTT 50mM （3）RNase Inhibitor（40U/μl）：抑制5ng RNase A活性的50%所需要的酶量定义为1个活性单位（U） （4）DEPC处理水 （5需DEPC处理及高压器材：10μl Tip头经DEPC处理后高压、干燥。 方法 （1）总RNA消化反应体系： 总RNA 16μg 10×DNase I Buffer 2μl DNase I 0.5μl RNase Inhibitor 0.25μl DEPC处理水 加至20μl （2）37℃反应30min,65℃反应5min(灭活DNA酶) （3）测浓度：1μl RNA+99μl DEPC水，测2个平行样，记录RNA浓度和A260/A280、A260/A230值， 注：RNA纯品的A260/A280值2.0，若比值小于1.8说明有残留的蛋白质或酚的污染，若比值大于2.0，则提示RNA有降解；A260/A230正常情况下应大于2.0，若小于此值则可能被异硫氰酸胍污染。 （14）稀释成RNA工作液（0.5μg/μl），取工作液1μl进行普通胶电泳。 RNA的反转录 材料 （1）消化后的总RNA （2）随机引物（10mM，10×）： （3）MMLV RTase（200U/μl）：活性定义为。每200U最大可反转录5μg 总RNA。 （4）MMLV 5× Buffer：含Tris-HCl（pH8.3，25℃）250mM，KCl 375mM，MgCl2 15mM，DTT 50mM。 （5）dNTP（10mM，20×）： （6）RNase Inhibitor（40U/μl）： （7）DEPC水 方法 （1）用2μl RNA工作液（0.5μg/μl），加3μl随机引物，70℃变性5min，冰上冷却，短暂离心。 （2）加入按如下反应体系做成Mix：（15μl /管） MMLV 5× Buffer 4μl dNTP（10μm） 2.5μl RNase Inhibitor 0.25μl（0.5U/μl） MMLV RTase 1μl 加DEPC水 7.25μl 反应总体积 20μl （3）振荡混合，短暂离心，37℃保温90min；80℃灭活5min，12℃10min（PCR仪操作）,分装后-20℃或-80℃保存。 （4）为检验有无内源基因组DNA和外源核酸污染，应设置双阴性对照（其中以不加反转录酶检测基因组DNA污染，用DEPC水代替RNA样品检验外源核酸污染）。 RT-PCR检验反转录效果 材料 （1）18S RNA引物（10mM，10×） （2）Taq DNA Ploymerase Buffer（10×） （3）MgCl2（25mM）：终浓度为1mM、1.25mM、1.5mM （4）dN