基因工程的操作过程zp2节.ppt

PCR技术 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶 PCR技术的原理 1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 基因组DNA 引物 DNA聚合酶 DNA片段体外扩增 PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 法医学检测 人类学研究 …… PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 基因组DNA 获取特定DNA片段 扩增特定DNA片段 限制性内切酶裂解 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 基因组DNA文库 DNA文库 20kB fragments 插入噬菌体载体 细菌扩增 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 1983年 94℃变性 50-65℃退火 XX℃延伸 94℃ 55℃ 37℃ Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 体内DNA的复制 DNA聚合酶 dNTP 解旋酶类 引物 5’ 3’ 加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR扩增原理 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 2 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 2 ）特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记 3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。 目的基因 载体 复制子 宿主细胞 扩增 扩增 提取DNA分子 4 ）用途广泛 生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 ? 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料