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受体研究技术 Techniques in receptor research ;相关帮助;第八章 组织化学技术在受体定位中的应用;免疫组织化学优缺点 ;包括﹕ 1.抗原(受体)提取和纯化 抗原可为完整蛋白或一段特异性片段。 2.免疫动物或细胞融合(单克隆抗体)。 3.抗体效价检测和提取。 4.抗体标记。 5.细胞和组织标本的制备。 6. 免疫组织化学反应和显色。 7.观察和记录结果。 ;免疫组织化学标本的制备;保持细胞和组织的原有结构, 防止组织自溶.不仅使细胞和组织内蛋白质凝固，终止和抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度地保存 细胞和组织的抗原性及防止抗原的扩散。 ;固定组织时应注意: *力求保持组织新鲜, 勿使其干燥, 尽快固定处理. *组织块不易过大过厚, 必须小于 2cm x 1.5cm x 0.3cm, 尤其是组织块厚度须保持在0.3cm 以内. *固定剂必须有足够的量, 在体积上一般大于组织20倍。 *组织固定后, 应充分水洗, 去除固定剂, 以减少固定剂造成的人为假像.; 载玻片处理 ;免疫组织化学方法 ;免疫荧光组织化学;A.用免疫荧光组织化学间接法显示角质细胞生长因子受体(Keratinocytew Growth Factor receptor, KGFR)定位于细胞的细胞膜。B.在KGFR抗体孵育液中加入过量KGFR，染色结果为阴性。标尺：50um , (Yuan et al. Gastroenterology 2002, 122(Suppl):866) ;双重免疫荧光染色 ;(二) 免疫酶组织化学 ;① 酶催化的底物必须是特异的且易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察； ② 所形成的终产物沉淀必须稳定, 即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散， 影响组织学定位。 ③ 酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性。 ④被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物 ;辣根过氧化物酶 (Horsh Radish Peroxidase, HRP) 具有稳定性强和反应特异高等优点, 且主要分布于植物中, 是目前应用最多的酶标记物. 碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, ALP) 葡萄糖氧化酶 (Glucose Oxidase, GOD)也较为常用 ; 该方法的基本原理为 PAP 复合物中的抗HRP抗体和第一抗体来自相同种属的动物，特异性一抗与组织细胞中抗原结合，二抗作为桥抗体将过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物(PAP)连接在与组织细胞内抗原结合的一抗上. ;A.用免疫酶组织化学ABC法显示甲状腺激素受体β2在大鼠中缝核神经无细胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲状腺激素受体β2抗体，所染色结果为阴性。标尺：50um.(YUAN ET AL. brain Research 2000,868:22) ;第二节 在受体定位中原位杂交组织化学的原理和方法;一 探针;标记探针 ;二 原位杂交组织化学反应 ;2 放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交;用35S标记的寡核苷酸探针显示谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)的两种不同形式GAD65和GAD67 mRNA在大鼠内侧脚间核(Endopeduncular Nicleus,EP)的分布. GAD65mRNA的表达在EP头侧(A)明显高于EP尾侧(B)。与GAD65相反， GAD67的mRNA表达在EP头侧(C)明显低于EP尾侧(D)。标尺：20um.(Yuan et al. Neuroscience 1997,78:87);3 地高辛标记的RNA探针的原位杂交 ; 由于mRNA易被染色过程中污染有少量RNA酶的液体所降解，因而实践中往往先进行原位杂交组织化学染色，但对某些较敏感易丢失的蛋白质或生物活性物质，需要先进行免疫组织化学染色，二者须加以平衡考量。 在应用双重染色法中，选用的固定剂除了能保持组织细胞良好的形态结构，还要同时有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定剂为4%多聚甲醛 .;用地高辛标记探针进行原位杂交，显示 KGFFR mRNA在细胞中的定位。A.用反意义链探针杂交显示 KGFFR mRNA定位于细胞质。B.用有意义链探针杂交，杂交信号明显减少。标尺：50um.(Yuan et al. Gastroenterology 2002,122(Suppl):866) ;原位杂交组织化学的对照实验 ;感谢您的浏览