天津大学生物化学05五节——核酸化学教程.pptVIP

2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-1） 是1979年，Arber、Smith和Nathams等人在细菌体内发现的一类对DNA具有极高碱基专一性的内切酶。 是DNA顺序测定，基因分离和基因体外重组等研究中十分重要的工具酶。 这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，但不降解自身细胞的DNA。 一般识别顺序包含4-6个碱基对。 （3）限制性内切酶(限制酶) 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-2） 大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构（反向重复序列）。 （3）限制性内切酶(限制酶)2 T T A G C A C G T G C T A A A A T C G T G C A C G A T T 反向重复 3， 5， 3， 5， 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-3） 大多数酶切割后形成粘末端 （3）限制性内切酶(限制酶)3 G A A T T C C T T A A G 3， 5， 3， 5， EcoRI G A A T T C C T T A A G 3， 5， 3， 5， + 粘性末端 粘性末端 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-4） 少数酶切割后形成平整末端 （3）限制性内切酶(限制酶)3 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3， 5， 3， 5， HindII 平整末端 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3， 5， 3， 5， + 3．非专一性核酸酶类1 （1）蛇毒磷酸二酯酶 （2）牛脾磷酸二酯酶 3．非专一性核酸酶类2（1） 对RNA、DNA都有作用，是从核苷酸链的3，—羟基端开始，逐个切开5，－ 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得到5，－核苷酸。 （1）蛇毒磷酸二酯酶 P P P H2O OH P P P OH OH + 3．非专一性核酸酶类2（2） 可作用RNA和DNA，是从5，-羟基端开始，逐个切开3，-核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得3，—核苷酸。 P P P H2O OH + （2）牛脾磷酸二酯酶 P P OH P P P OH （二）核酸的杂交技术1 意义：核酸杂交可以在液相或固相上进行，是基因工程和分子生物学的重要技术之一。是鉴定阳性重组体、筛选基因、确定DNA的同源性、研究基因定位、组建DNA的物理图谱、研究DNA的间隔顺序等的有效手段。 原理:核酸（DNA）的变性和复性的性质，也就是在带有互补顺序的同源单链间的配对过程中，DNA单链可重新形成双链，DNA单链也可与RNA互补成为杂交分子。因此有DNA类、DNA-RNA类两种杂交。如把已知序列的分子预先用放射性同位素（32P）标记（称为探针，Probe），即可用其识别或“钓出”另一分子中的同源部分。 （二）核酸的杂交技术2 Southern 印迹法:利用上述原理，1975年英国分子生物学家E.M.Southern首先发明的一种杂交 “印迹法”。 此法是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后，再进行杂交 具体方法参见北大P352,353。 （二）核酸的杂交技术3（1） 1．将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼酯糖凝胶电泳进行分离 2．将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA变性 3．将变性DNA转移到硝酸纤维膜上（膜只吸附变性的DNA） 4．800C烤4-6h，，使DNA牢固地吸附在膜上 DNA－ DNA杂交实验法1 （二）核酸的杂交技术3（2） 5．与放射性同位素标记的、变性后的DNA探针进行杂交，此过程需要在较高的盐浓度及适当的温度（一般680C）下进行了几～十几个小时 6．洗涤除去杂交标记物 7．将膜烘干后进行放射自显影 DNA－ DNA杂交实验法2 （二）核酸的杂交技术3（3） Northern印迹法:根据此原理，1977年G.R Stark建立了测定RNA的分子杂交技术。 Western bloting:用类似的方法，根据抗体与抗原可以结合的原理，开发了分析蛋白质的方法。 DNA－ DNA杂交实验法3 四、核酸序列分析1 1965年Robert Holley首先用测蛋白质氨基酸的序列方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸tRNA的序列。 1977年两位学者提出了化学裂解法和双脱氧酶法。这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸的顺序。即利用凝胶电泳使各