Chapter 7色谱技术.ppt

本章主要知识点 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分类 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。 流动相：指色谱过程中携带组分向前移动的物质。 固定相：指色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面上的液体。 色谱法(Chromatography)从二十世纪初发明以来，经历了整整一个世纪的发展到今天已经成为最重要的分离分析科学，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护，乃至空间探索等。 将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现，这种层析现象虽然古人就已有初步认识并有一些简单的应用，但真正首先认识到这种层析现象在分离分析方面具有重大价值的是俄国植物学家Tswett。 ◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。　 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。 色谱（层析）的发展史 色谱（层析）的发展史 色谱技术概念（分配色谱） 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 色谱分离图示 色谱（层析）分类 常见用于生物大分子分离的各类色谱法的特点 色谱法的优点 （1）分离效率高。复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2）应用范围广。气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 （3）分析速度快。一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。可以检测出μg.g-1 (10-6 )级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。 不足之处： 被分离组分的定性较为困难。 色谱分离的基本概念 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 t R --保留时间 W1/2---半峰宽 Wb --峰底宽度 理论塔板高度：L---柱长 一般色谱系统的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 色谱柱装置图 （一）装柱 装柱是成功得到分离物质最关键的一步。一般实验室采用重力沉降法和加压法进行装柱。 （三）上样量和上样体积 上样体积越小，量越少，分离效果越好。 对于分析型色谱，加样量一般不超过柱床体积的0.5%-1%，制备型色谱加样量一般不超过柱床体积的1%-3%。分子筛加样量要远小于离子交换色谱。 （四）洗脱 改变洗脱液的pH,使大分子的电荷减少，从被吸附状态变为解离状态。 改变离子强度，增加洗脱液的离子强度，将被分离物从交换剂上换下来。 同时改变pH及离子强度。 洗脱方式有三种：一步洗脱、阶段洗脱、梯度洗脱 梯度洗脱 洗脱液中含有两种或以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变洗脱液中溶剂的配比和极性，通过洗脱液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。 它可使分离时间缩短，分辨能力增加，提高最小检出量和精度。 与气相色谱的程序升温作用相似。 （五）流速及控制 洗脱液的流速会影响色谱的分辨率，在整个分离过程中，要保持一个稳定的流速。此流速要经过反复实验来确定。 流速过高，使色谱峰加宽，降低分辨率。 流速可通