初步研究cag方案对急性髓细胞性白血病的治疗机制-内科(血液学)专业论文 word格式.docxVIP

4.细胞计数及增殖抑制实验将待计数细胞充分打匀后，吸500μL于计数杯中，加入9.5mL鞘液后混匀，用细胞计数分析仪计数分析并计算细胞增殖抑制率。计算方法为：细胞生长抑制率=[1-（处理组细胞绝对数/对照组细胞绝对数）]×100%。5.细胞形态学观察取各处理组细胞（约2×104个细胞），充分打匀，细胞涂片仪离心涂片（800rpm/min,5min）后，Wrights染液染色两分钟左右，油镜下观察细胞形态。6.细胞表面分化抗原检测收集各处理组细胞于两支流式管（每支流式管至少2×105个细胞）中，离心去上清后各加100μLPBS，分别加入4μL抗CD11B及其同型对照IgG1单克隆抗体，混匀。室温避光孵育30min后，2mLPBS洗涤，弃去上清，各流式管中加入400μLPBS，打匀，流式细胞仪计数5000个细胞，检测抗原CD11B的表达情况。7.细胞凋亡检测收集各处理组细胞于流式管（每支至少2×105）中，离心去上清，加100μLPBS，2μL罗丹明123标注混匀。室温避光孵育30min后，2mLPBS洗涤两遍，加400μLPBS。上机检测前5min加入5μLPI（50μg/μL），混匀，流式细胞仪计数10000个细胞，检测细胞凋亡情况。8.细胞周期测定收集各处理组细胞（约1×106）至离心管中，离心去上清后，加入70%的酒精，混匀，4℃固定24h。标本检测时做如下处理：将固定过的细胞用5mLPBS洗两遍，加入100μLPBS，混匀。各离心管中加入50μLRNA酶（1mg/mL）37℃消化30min，各管再加入400μLPBS并将细胞液转入相应流式管中，上机前5min各管加PI（250μg/μL）50μL，混匀，流式细胞仪计数10000个细胞，检测细胞周期分布。结果采用ModfitLT3.0软件进行分析。9.蛋白样品收取及考马斯亮蓝染色分别收取各处理组细胞2×106个于15 mL离心管中，离心后去上层培养基，再加入1mLPBS打匀，并转入相应的EP管中。离心（3000r,5min）后，去上清，各EP管中加入100μL煮沸的蛋白裂解液（4%SDS,10%甘油,100mMTris碱PH=6.8,5%β- 巯基乙醇,0.2%溴酚蓝）。再用研磨枪充分研磨细胞，离心，后沸水煮10-15min以使蛋白充分变性，冰上冷却。再离心混匀后等待电泳上样，余下的样品保存在-20℃冰箱中。取各样品蛋白7.5μg 左右加样于10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶中，150V恒压电泳1-1.5h左右（电泳缓冲液：25mMTris,250mMGlycine,0.1%SDS）。电泳结束后，取胶并切角标记，置于考马斯亮蓝染液中摇床（50r/min）染色1h，取出后摇床（80r/min）上清水漂洗过夜，第二日观察结果并拍照保存。10.免疫印迹蛋白样品准备及电泳方法同方法9所示（但电泳时样品量由7.5μg左右调至20μg 左右）。电泳结束后，恒压100V常规转膜1.5-2小时（转膜缓冲液：48mMTris,39mMGlycine,0.0375g/LSDS,pH9.2），印迹膜经含5%脱脂奶粉的TBS（10mMTris,150 mMNaCI, PH=7.6）室温封闭1小时后，与用含5%脱脂奶粉或BSA的TBS-T（含0.1%Tween-20的TBS）稀释的一抗4℃孵育过夜。经TBS-T充分洗涤3次（10min/次摇速90r/min）后，与用含5%脱脂奶粉的TBS-T稀释的二抗（1:5000）室温反应1小时。经TBS-T充分洗涤3次（10min/次摇速90r/min）后，再换用TBS洗涤一次，然后用ECL试剂盒显影。11.统计学方法统计软件选用SPSS17.0，采用组间方差分析，结果以均数±标准差表示（n=3）。结果1.各加药组对U937细胞的增殖抑制情况各加药组（详见“实验分组” ）处理U937细胞2天，计数细胞的生长情况并按方法4中所述公式计算各处理组细胞的增殖抑制率，可见：rhG-CSF单用时可轻微促细胞生长，含Ara-C各组对细胞生长均有较明显的抑制作用，但Ara-C单用组与CAG组相比并无显著差异（P0.05见表1、图2）。表1各加药组对U937的增殖抑制(x±S)Tab 1Theproliferationinhibition of U937in eachgroup (x ± S)各处理组增殖抑制率( %) 1D2DAra-C28.83±3.1734.77±3.68rhG-CSF-1.41±2.11-8.63±1.07ACR3.23±2.7510.30±3.21rhG-CSF+ACR2.25±0.768.97±8.75Ara-C+ACR31.37±0.2536.53±4.79Ara-c+rhG-CSF25.97±5.8427.20±5.20CAG26.23±6.3734.