ITS测序.pptVIP

二、PCR加样体系 真菌DNA模版 2μL 10×buffer 2.5μL MgCl2（25mM） 2μL dNTP（各2.5mM） 2μL 上游引物ITS1 （10μM） 1μL 下游引物ITS4 （10μM） 1μL rTaq酶（5U/μL） 0.3μL ddH2O 14.2μL 总体积 25μL PCR反应条件 94℃预变性4min； 94℃变性1min 50℃退火1min 72℃延伸1min 72℃总延伸10min； 10 ℃保温。 32个循环 1.凝胶制备 制备1.0%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10μl DNA样液与 2μl 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.EB染色 5.观察拍照 三、琼脂糖凝胶电泳 泳道1：DL2000 泳道2：PCR产物 ITS测序结果 1 TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC 61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG 121 GGCGCCTTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA 181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG 241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG 301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT 361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG 421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT 481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA TTTTTTCCAG 541 GTTGACCTCG GATCAGGTAG GGATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA 登陆Genbank blast在线比对 序列比对分析 谢谢！ 利用ITS序列鉴定未知真菌 温永芳 2015.6.12 1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作 目录 微生物鉴定 生理生化 形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等 分子鉴定 细菌：16s rDNA 真菌：ITS序列 一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法 ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以及系统发育分析。 二、PCR原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度