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利用透膜荧光小分子探针对半胱氨酸组织蛋白酶蛋白活性表达谱的分析-生物医学工程专业论文 word格式
独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:日期:年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□,在年解密后适用本授权书。不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名:指导教师签名:日期:年月日日期:年月日摘要*在后基因组时代,最重要的工作就是要从整体水平上了解蛋白质的表达和功能。在众多的蛋白质分析方法中,蛋白质活性表达谱(activity-based protein profiling, ABPP)是研究酶的表达和功能的主要方法之一,这种方法的主要工具是一种基于酶活性的小分子探针(activity-basedprobe,ABP)。ABP 探针是运用有机化学方法人工合成的靶向性小分子探针,利用它可以将蛋白质组中一类特定的蛋白酶识别标记,随后通过凝胶电泳、质谱鉴定等方法手段,对酶的表达和功能进行一系列分析。细胞膜是阻止胞外物质自由进入细胞的屏障,也为ABP 探针在活细胞内的应用带来一定困难。突破细胞膜的限制,实现ABP探针在活细胞以及在体水平的应用,是蛋白质活性表达谱研究的重要发展方向。本课题将细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide, CPP)应用到ABP 探针的设计中,合成了针对半胱氨酸组织蛋白酶的特异性探针:CpFABP和TCpABP。利用TCpABP探针标记活细胞中的半胱氨酸组织蛋白酶,对标记蛋白酶进行了基于质谱技术的鉴定分析;将CpFABP探针作为一类新型的溶酶体标记物,对溶酶体依赖型细胞凋亡的起始阶段进行了实时荧光成像分析。主要研究结果如下:(1)用固相和液相结合的方式合成了针对半胱氨酸组织蛋白酶的一系列ABP 探针,包括含有八聚精氨酸和环氧探头的CpFABP、TCpABP 透膜探针以及几种用于对照实验的探针。通过改进纯化办法,解决了透膜探针在纯化的过程中容易发生环氧开环的问题,获得高纯度的探针。(2)TCpABP 探针含有反应基团、荧光基团和Biotin 基团,是一种具有透膜能力的三功能(trifunctional)探针。研究结果表明,尽管这种三功能探针含有不能够透膜的荧光基团和Biotin 基团,但是因为探针中含有八聚精氨酸穿膜肽,TCpABP* 本课题受到国家高技术研究发展计划(863计划)(2008AA02Z107),国家自然科学基金,国家重大科学研究计划项目(2011CB910401)的资助。I探针能够有效透膜进入细胞,实现了在活细胞中对活性状态的半胱氨酸组织蛋白酶的标记。利用TCpABP探针中的Biotin基团,我们富集了被标记的活性半胱氨酸组织蛋白酶,并且通过步骤优化减少了非特异性结合的蛋白,降低了背景蛋白数量。在经过质谱鉴定之后,我们总共得到59个蛋白质,包括7种半胱氨酸组织蛋白酶,其中两种(CathepsinF,CathepsinO)在以前的ABPP分析中是没有被检测到的。我们通过基于图谱计数的非标定量方法对已鉴定蛋白进行相对定量分析,发现半胱氨酸组织蛋白酶大多丰度值很高,而其余的52个蛋白的丰度较低。这些研究证明了TCpABP 探针在活细胞对半胱氨酸组织蛋白酶标记的高特异性,碱洗富集策略降低背景的有效性和“一步法”鉴定的高灵敏性。将鉴定的半胱氨酸组织蛋白酶的的相对活性值同mRNA的转录水平的数据进行比较分析,发现在7 种组织蛋白酶中,六种的蛋白活性水平同mRNA转录水平相关性很好,相关系数达到0.84,但是Cathepsin H的蛋白活性水平同mRNA的水平差异很大,说明其mRNA水平同蛋白质的表达是不成线性的。(3)在正常的生理条件下,活性半胱氨酸组织蛋白酶定位在溶酶体中,我们系统评估了CpFABP探针作为一种新型的溶酶体标记物标记溶酶体的特性。通过与商用的溶酶体标记物LysoTracker 进行共定位分析,结果表明CpFABP探针能够在各种不同类型的培养细胞中有效的标记溶酶体。此外,CpFABP探针在标记溶酶体后,可用于细胞固定,细胞膜透化作用以及氯化铵碱化处理等各种操作;而在相同的条件下,商用的LysoTracker 失去了标记能力,显示了CpFABP探针作为溶酶体标记物具有自己独特的优势。在溶酶体依赖型凋亡研究中,利用C
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