第05章-细胞培养与常用病毒学技术.pptVIP

体外培养的细胞有两种基本形态 静置培养 试剂的配制： 病毒接种与收获： 同步接种和异步接种： 选择敏感细胞：获得高滴度的病毒液 若用细胞繁殖病毒，针对不同病毒，需选择其相应的敏感细胞； 鸭瘟病毒可用鸡鸭鹅胚成纤维细胞； 马立克氏病病毒可用鸡胚和鸭胚成纤维细胞； 口蹄疫病毒可用BHK21、PK15等； 未知病毒，通过研究确定敏感细胞。 影响病毒繁殖的因素: 血清：接种病毒后，需使用维持液，即培养基中的血清含量减至2%；若血清影响到病毒繁殖，可用无血清培养基。 温度：37℃，某些病毒的最适温度或高于或低于37℃，如狂犬病病毒的最适温度为32℃。 pH：细胞生长时可产酸，虽然受病毒感染影响，细胞产酸能力下降，但由于大多数病毒的繁殖需要3~7d，故维持液中酸性物质仍可蓄积，配制维持液时可偏碱。 病毒接种量：适当稀释后，体积为维持液的1%～10%。 复习思考题 3.准备鸡胚与毒种 1. 动物的选择标准 1. 细胞长好后，再接种病毒，为异步接种法 2. 某些病毒(如细小病毒)需采用同步接种，才能更好地繁殖，即，在单细胞悬液分装后或分装后4h内，同时接种病毒。 3. 合适的病毒吸附时间和收毒时间可参阅相关文献。 4. 不产生CPE的病毒，可使用一些间接的指标，如免疫学方法 病毒毒价的测定：TCID50、空斑试验。 1. 概念：细胞培养、原代细胞、细胞株、细胞系、细胞 的传代、静置培养、转瓶培养。 2. 用细胞培养繁殖病毒时，有哪些因素可影响到病毒的 增殖？ 3. 细胞培养有哪些方式？ 禽胚：鸡、鸭、鹅胚。许多病毒适合于禽胚繁殖；禽胚来源充足；操作简单。 （二）用禽胚培养病毒 目的：适于对禽胚敏感的动物病毒的分离、培养； 病毒滴度的测定； 中和试验：病毒的鉴定、分型、抗体检测； 抗原制备； 广泛用于生物制品的研究和生产。 1.禽胚的选择 根据不同病毒选择不同禽胚： 鸡胚：禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、禽痘病毒。 鸭胚：狂犬病病毒、减蛋综合征病毒。 鹅胚或番鸭胚：鹅细小病毒(小鹅瘟)、番鸭呼肠孤病毒。 大头朝上：蛋壳、壳膜与气室 2. 鸡胚的结构 撕开壳膜，露出绒毛尿囊膜 壳膜 尿囊膜 9日龄鸡胚结构： 鸡胚孵化：37～38℃、相对湿度为53%～57%的条件下孵化，孵育3日后，每日翻蛋1～2次。 孵至第4日，用照蛋器观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动；随后每日观察一次，将胚动呆滞或不动、血管昏暗模糊者，随时淘汰。 生长良好的鸡胚孵育至接种前。 准备毒种：将病毒毒种用灭菌生理盐水进行适当稀释分离病毒时，用适量生理盐水加入病料中研磨、加抗菌素抑菌、离心取上清、经无菌检验后用于接种。 1）尿囊腔接种：选9～10日龄鸡胚。新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒等。 2）绒毛尿囊膜接种 3）卵黄囊接种 4）羊膜腔接种 5）脑内接种 6）胚体接种 7）静脉接种 4.接种 根据不同病毒选择不同途径： （1）照胚：在气室中部做记号，在靠近胚胎一侧、气室边缘或偏下处划出接种部位。 × × × × × 避开大血管 （2）消毒接种部位 （3）打孔 （4）接种 稀释病毒液 0.1～0.2ml/胚 （5）石蜡封口 （6）置37℃温箱培养 每日照胚、24小时内死胚弃之，根据不同病毒培养至合适时间。 接种后，收获时间视不同病毒而异。 一般收集死亡鸡胚，有些疫苗也收集存活鸡胚。 置冰箱过夜或冰柜0.5~1 h冷却使血液凝固，避免某些有血凝活性的病毒与红细胞凝集造成病毒滴度下降。 消毒气室处蛋壳，去除蛋壳和壳膜。 收获鸡胚的何种组织，依不同的病毒而定主要考虑组织的含毒量高低。 取出尿囊液、胚胎、尿囊膜，制成匀浆，加适量抗菌素。制备鸭瘟弱毒疫苗时，加入保护剂制成冻干品；匀浆中加甲醛灭活为鸡胚组织灭活苗。 （7）收获全胚或尿囊液 用吸管穿过绒毛尿囊膜插入尿囊腔，吸取尿囊液和羊水，加保护剂冻干即为新城疫弱毒疫苗； 而含新城疫病毒和禽流感病毒的尿囊液用甲醛灭活，加油乳佐剂乳化，即为油苗。 收获尿囊液： 影响病毒增殖的因素： 1）种蛋质量：最终影响到疫苗的质量，应使用SPF鸡胚。 蛋传微生物：白血病病毒、脑脊髓炎、腺病毒、支原体、传染性贫血因子、沙门氏菌等，既污染生物制品，又影响病毒繁殖。 母源抗体：种鸡免疫后、或感染过病原后，种蛋会含有母源抗体，可