根据质谱DNA加合物之检测方法.pptxVIP

基于质谱的DNA加合物之检测方法; DNA加合物是指缘于环境暴露外源的，或因体内应力产生的内源的，反应活性的或经代谢活化后的亲电性物质与DNA碱基上亲核位点共价结合形成的化合物。DNA加合物既是环境遗传毒性物质在体内靶向累积的结果，除了可以作为环境暴露剂量的标志物外，又因其是诱变和癌变的引发步骤，所以又是生物效应的标志物，其检测对于环境暴露监测及其风险评估具有重要意义。;图.DNA加合物的遗传毒性过程示意图;传统方法;图.32P-后标记流程图;分析策略;图.DNA加合物的分析策略示意图;分析流程; 对于靶向分析，在对样品进行·质谱全扫描后，与预先列出的加合物分子列进行比对，若是预期目标分析物则触发分子碎裂，在MS2阶段进行中性扫描，筛选出加合物，进而在MS3阶段进行子离子扫描，以便获取其结构信息；对于非靶向分析，则是在全扫描后，根据数据关联方法，选出全扫描质谱中高强度的分子离子进行碎裂，其后的分析流程如同靶向分析。;分析原理;碱基加合物 很多DNA加合物的热稳定性较差，如许多烷基化试剂在嘌呤碱N-7和N-3形成的加合物，经热解会从DNA骨架上脱落下来，留下单纯的碱基加合物，有些加合物虽然是热稳定的，但可以在中度酸解条件下脱落下来，且加合物本不发生断裂，因此在质谱过程中可以通对碱基中性丢失（G，151.04941；A,135.0545；T,126.0429；C,111.0433）扫描筛选加合物，这是一种通过制备碱基加合物，进而由质谱对加合物进行测定的方法。;图.DNA加合物的结构特点及中性扫描探测。Base，碱基；M，加成修饰物；dR，2′-脱氧核糖；(A)用于核苷加成物扫描分析的传统的核苷（-dR）丢失检测，(B)碱基中性丢失的扫描策略。;样品制备;仪器选型;图.三重四极杆—线性离子阱复合质谱系统;图.线性阱和静电场轨道阱组合质谱; 线性阱和静电场轨道阱组合质谱，前端为可独立工作的LTQ(低分辨)，可完成离子阱诸如MS，MS/MS,和MSn分析，而在进行高分辨率/准确质谱时，LTQ的作用主要是富集和产生多级碎片，传送到C-trap后经聚焦成束后通过S透镜送入Orbitrap（高分辨）,根据样品的复杂程度和分析要求，可从7500-100000设置不同的分辨率进行???析。;分析过程;例图;图.PEG修饰DNA加合物的质谱分析。（A）中性丢失（116Da）扫描的质量色谱图，色谱图中除看到自由碱基（dC，dA，dG和T）峰外，还有簇拥在一起的碱基加合峰，包含4种质量的离子，分别为402，379，418和393；(B）质量为402的峰1与峰2的质量色谱图；(C)峰1的子离子谱；（D）峰2的子离子谱。;例子;检测过程 分析由全扫描检测，跟着进行数据依赖MS2数据获取，然后由中性丢失事件触发MS3碎片分析。全扫描在Orbitrap上完成，分辨率为7500，自动增益控制（AGC）为1×105，扫描次数1，离子注入最长时间100ms；MS2碎裂参数：隔离宽度3amu，归一化碰撞能量25，活化Q值0.25，活化时间10ms；数据依赖参数：排除列大小500，排除间隔60s，排除质量耐受宽带±5ppm，排除列包括四个碱基的离子化（H+，Na+, K+和NH3+）单核苷及二聚体，空白对照样品的最强离子；MS3碎裂（隔离宽度2amu，归一碰撞能量35，活化Q值0.25，活化时间30ms）采用LTQ检测，由母离子与MS2谱前50强子离子间相差116.0474事件触发，测定参数如下：微扫描数3，重复计数1，（AGC）1×104 ，离子注入最长时间50ms。 ;质谱结果 图.标准混合物中O2-POB-dT的色谱和质谱输出。（A）O2-POB-dT 的MS3质量扫描色谱流出图，由MS全扫描的离子（在C图的19.17min）与相应MS2离子(在B图的18.18)间质量差为116.0474事件所触发；A1是O2-POB-dT的MS3质谱图,C1是由全扫描提取的m/z=390.1660离子的色谱流出图。 ;定量过程;同位素内标法 同位素内标是指DNA加合物上的H，C，N，S和O等元素被其相应的稀有同位素所取代而形成的标记化合物。标记物常在样本处理前加入，其与天然的DNA加合物具有相同的色谱特性和共同的裂解规律，形成的质谱峰则可由二者之间预期的质量差值确定，同时制备过程的回收率以及测定过程离子化和检测效率等均一致，因此在相对比较定量时无需对以上诸多影响因子进行校正。相对定量公式如下： ;式中，LSa为样品加合物的水平（个/108核苷），Aa为加合物离子色谱流出峰的面积，LSb为添加的内标加合物的水平（个/ 108 核苷），Ab为内标离子色谱流出峰的面积。 校准曲线 取一定量的背景D